Distrofia musculara Duchenne/Becker (deletii/duplicatii MLPA)

Informaţii generale

Distrofinopatiile includ un spectru de boli musculare cauzate de mutaţii ale genei DMD care codifica distrofina. Formele clinice de boala au severitate variabila şi prezinta o transmitere legata de cromozomul X; cele mai uşoare fenotipuri includ creşterea asimptomatica a activitaţii creatinkinazei serice, crampe musculare însoţite de mioglobinurie şi miopatie de cvadriceps izolata; la polul opus se situeaza afecţiunile musculare progresive clasificate în doua mari categorii: distrofia musculara Duchenne/Becker, atunci cand sunt afectaţi în principal muşchii scheletici, şi cardiomiopatia dilatativa asociata cu mutaţii DMD, atunci cand afectarea cardiaca este pe primul plan¹.

Distrofia musculara Duchenne este cea mai frecventa forma de distrofie musculara ce afecteaza 1 din 3500 baieţi. Manifestarile clinice debuteaza în prima copilarie cu dificultaţi în învaţarea mişcarilor, alergare, urcatul scarilor şi ridicarea de la sol. Mersul este leganat sau pe varfuri şi exista o tendinţa marcata de cadere. Boala progreseaza rapid, astfel ca în jurul varstei de 12 ani copiii îşi pierd capacitatea de a merge şi devin imobilizaţi în scaunul cu rotile. Reducerea performanţelor intelectuale este înregistrata în aproximativ 30% dintre cazuri. Complicaţiile cardiace (cardiomiopatia) apar dupa varsta de 18 ani şi reprezinta, împreuna cu tulburarile respiratorii, principala cauza de deces. Rata de supravieţuire este foarte redusa dupa decada a treia de viaţa. In 1986 Duchenne a stabilit criteriile de diagnostic ale bolii care sunt inca folosite: slabiciune ce debuteaza la nivelul membrelor inferioare; hiperlordoza şi mers cu baza de susţinere largita; hipertrofia muşchilor gambei; evoluţie progresiva in timp; reducerea contractilitaţii musculare la stimularea electrica; absenţa disfuncţiilor sfincteriene şi a starii febrile. Gowers a fost primul care a dedus baza genetica a acestei afecţiuni şi a descris unii pacienţi cu debut tardiv al manifestarilor clinice. In 1962 Becker a considerat ca pacienţii cu un fenotip mai puţin sever de boala prezinta de fapt mutaţii mai uşoare la nivelul aceleiaşi gene. In prezent aceştia sunt incadraţi in distrofia musculara Becker^1;4.

In 1986 Kunkel a identificat gena distrofiei musculare Duchenne ca fiind localizata la nivelul benzii Xp21 şi a confirmat astfel modul de transmitere X-linkata a bolii.

Distrofia musculara Becker are o prevalenţa de 24 cazuri la un 1 milion şi are de asemenea o transmitere legata de cromozomul X. Fenotipul este generat de mutaţii genetice diferite de cele implicate in maladia Duchenne insa gena afectata este comuna (DMD). Distrofia Becker debuteaza clinic la o varsta mai mare şi inregistreaza o evoluţie clinica mai lenta. Imobilizarea in scaunul cu rotile se produce dupa varsta de 20 ani; deşi afectarea musculaturii scheletice este mai puţin severa decat in boala Duchenne, insuficienţa cardiaca generata de cardiomiopatia dilatativa este o cauza importanta de morbiditate şi mortalitate.

Ca urmare a transmiterii X-linkate, atat boala Duchenne cat şi boala Becker se manifesta aproape in exclusivitate numai la baieţi. Foarte rar femei purtatoare de mutaţii DMD dezvolta fenotip Duchenne/Becker ca urmare a inactivarii intamplatoare a cromozomului X neafectat, asocierii sindromului Turner (X0) sau a unei disomii uniparentale. Astfel, in majoritatea cazurilor femeile sunt asimptomatice, iar doua treimi dintre acestea prezinta creşteri ale activitaţii creatinkinazei⁴.

Cardiomiopatia dilatativa asociata cu mutaţii ale genei DMD se caracterizeaza prin dilatarea ventriculului stang şi insuficienţa cardiaca congestiva. La sexul masculin boala debuteaza clinic la varste cuprinse intre 20 şi 40 ani şi are o evoluţie rapida letala in timp ce la femei se inregistreaza un debut mai tardiv şi o progresie mai lenta. De obicei lipsesc semnele şi simptomele afectarii musculaturii scheletice.

DMD este singura gena asociata cu distrofinopatiile. Testele de biologie moleculara care evidenţiaza mutaţiile DMD pot stabili diagnosticul in majoritatea cazurilor de distrofie Duchenne sau Becker, fara a fi necesara biopsia musculara. Teoretic toti pacienţii de sex masculin cu distrofie Duchenne şi cel puţin 85% dintre cei cu distrofie Becker prezinta mutaţii DMD identificabile. Numarul pacienţilor cu cardiomiopatie dilatativa şi mutaţii DMD identificabile este necunoscut. In restul cazurilor, coroborarea datelor clinice cu istoricul familial, nivelul creatinkinazei serice, biopsia musculara şi analiza distrofinei confirma diagnosticul¹.

DMD este cea mai mare gena identificata in genomul uman; este alcatuita din 79 exoni şi are o rata inalta de mutaţii; se exprima in principal la nivelul musculaturii scheletice, netede şi cardiace. Proteina codificata – distrofina – este implicata in legatura mecanica dintre matricea extracelulara şi citoscheletul celular. In absenţa distrofinei este afectata integritatea sarcolemei şi este perturbata stabilitatea fibrei musculare. Deoarece creşte susceptibilitatea faţa de injuriile mecanice, fibrele musculare vor suferi cicluri repetate de necroza şi regenerare cu epuizarea in final a capacitaţii de regenerare. Mutaţiile DMD care provoaca fie absenţa completa a distrofinei, fie producerea unei proteine trunchiate sunt asociate cu fenotipul Duchenne. Pe de alta parte,  mutaţiile care afecteaza regiunea de mijloc a genei vor genera o proteina mai scurta care insa işi conserva domeniile carboxi- şi aminoterminale şi implicit funcţionalitatea; acestea sunt asociate cu fenotipul Becker^2;4.

Deleţiile mari care implica unul sau mulţi exoni sunt responsabile de aproximativ 59% din cazurile de boala Duchenne şi 65% din cele de distrofie Becker. Mutaţiile care induc apariţia prematura a unui codon stop sunt intalnite in 15% din cazuri, iar duplicaţiile in 5% din cazuri; in restul cazurilor sunt intalnite mutaţii ale cadrului de citire, inserţii/deleţii, mutatii ale situsului de splicing, precum şi mutaţii missens.

Deşi aproape toate cazurile de distrofie Duchenne sau Becker se transmit X-linkat, in o treime din cazuri nu exista istoric familial, fiind vorba de mutaţii de novo. Mozaicismul gonadal este responsabil de aproximativ 20% dintre cazurile noi de distrofie musculara Duchenne⁴.

Riscul ca fraţii unei persoane afectate sa dezvolte boala depinde de starea de purtator a mamei. Datorita transmiterii X-linkate a distrofinopatiilor femeile purtatoare prezinta un risc de 50% de a transmite mutaţia DMD la fiecare sarcina. Fiii care moştenesc mutaţia vor fi intotdeauna afectaţi, in timp ce fiicele care moştenesc mutaţia vor fi purtatoare şi pot sau nu sa dezvolte cardiomiopatie.

De obicei persoanele de sex masculin cu distrofie Duchenne sufera decesul inaintea varstei reproductive, in timp ce barbaţii cu fenotip Becker se pot reproduce, astfel ca toate fiicele lor vor moşteni mutaţia cauzatoare de boala, iar fii lor nu vor fi afectaţi.

Matuşile pe linie materna ale persoanei afectate, cat şi copiii acestora pot prezenta un risc crescut de a face boala sau de a deveni purtatori in funcţie de sexul acestora, relaţiile familiale şi starea de purtator a mamei.

O femeie cu un fiu afectat şi cu o alta ruda afectata pe linie materna este obligatoriu heterozigota pentru o mutaţie DMD.

O femeie cu mai mult de un fiu afectat şi cu istoric familial negativ prezinta fie o mutaţie a liniei germinale (mutaţia DMD cauzatoare de boala este prezenta in toate celulele sale), fie un mozaicism gonadal (mozaicismul pentru o mutaţie DMD cauzatore de boala este prezent numai in linia germinala).

Daca fiul cu afecţiune Duchenne/Becker reprezinta  singurul membru afectat din familie trebuie luate in considerare mai multe posibilitaţi legate de statusul de purtator al mamei:

a) fiul afectat prezinta o mutaţie de novo care a rezultat din:

b) mama prezinta o mutaţie de novo; aproximativ doua treimi din mamele baieţilor afectaţi de distrofie Duchenne/Becker şi fara istoric familial sunt purtatoare de mutaţii DMD; mecanismele prin care apar mutaţii de novo la mama sunt urmatoarele:

c) mama a moştenit o mutaţie de la:

Testarea genetica combinata cu analiza de linkaj poate stabili adesea originea unei mutaţii de novo. Aceasta analiza este importanta pentru identificarea acelei ramuri familiale care prezinta risc crescut de distrofinopatii¹.

Au fost dezvoltate mai multe tehnici de biologie moleculara pentru depistarea mutaţiilor genei DMD in probe de sange periferic, printre care se numara:

• multiplex PCR pentru detectarea deleţiilor (rata de detecţie ~ 95%);
• Southern blot şi PCR cantitativ pentru detectarea duplicaţiilor;
• MHPA (Multiplex Amplifiable Probe Hybridization) şi MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification) pentru analiza deleţiilor/duplicaţiilor;
• secvenţierea completa a genei DMD pentru detectarea mutaţiilor punctiforme, a deleţiilor şi inserţiilor mici, a mutaţiilor situsului de splicing^1;4.

Tehnica MLPA pentru gena DMD necesita doua tipuri de reacţii diferite datorita numarului mare de exoni. O reacţie include un amestec de sonde denumit PO34 ce acopera exonii 1-10, 21-30, 41-50 şi 61-70. Cea de a doua reacţie conţine un amestec de sonde denumit PO35 ce acopera analiza exonilor 11-20, 31-40, 51-60 şi 71-79. Studiile efectuate dovedesc ca aceasta tehnica ce „scaneaza” simultan toţi cei 79 exoni ai genei DMD pentru prezenţa deleţiilor/duplicaţiilor reprezinta un instrument util de diagnostic atat in cazul persoanelor de sex masculin afectate cat şi al femeilor purtatoare^2;5.

Recomandari pentru testarea genetica

• confirmarea diagnosticului de distrofie Duchenne/Becker la persoanele afectate;
• testarea rudelor cu risc crescut pentru identificarea femeilor purtatoare; ideal este sa se identifice in prealabil o mutaţie cauzatoare de boala in familie;
• diagnosticul prenatal la gravidele cu risc crescut pentru o mutaţie DMD; se efectueaza prin analiza ADN-ului extras din celulele fetale obţinute prin amniocenteza, de obicei efectuata la aproximativ 15-18 saptamani de gestaţie sau biopsia vilozitaţilor coriale, la aproximativ 10-12 saptamani de gestaţie; mutaţiile cauzatoare de boala trebuie sa fie identificate inainte de testarea prenatala^1;3;4.

Specimen recoltat – sange venos³.

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant³.

Cantitate recoltata –  5 mL sange³.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate³.

Stabilitate proba – 7 zile la 2-8ºC³.

Metode – analiza deleţiilor/duplicaţiilor MLPA³. 

Raportarea şi interpretarea rezultatelor

Vor fi comunicate deleţiile/duplicaţiile depistate in gena DMD şi asocierea lor cu un fenotip Duchenne/Becker conform datelor din literatura de specialitate³.

Identificarea unei mutaţii cauzatoare de boala la o persoana de sex masculin cu tablou clinic sugestiv şi niveluri crescute de CK confirma diagnosticul. Fenotipurile Duchenne/Becker se coreleaza cel mai bine cu gradul de expresie a distrofinei ce este determinata de cadrul de citire al ARN-ului mesager obţinut din alela mutanta. Astfel, deleţiile foarte mari pot conduce la absenţa expresiei distrofinei; de asemenea unele deleţii şi duplicaţii pot altera cadrul de citire şi determina producţia unei proteine sever trunchiate ce se asociaza cu fenotipul Duchenne. Fenotipul Becker se dezvolta atunci cand se menţine o anumita producţie de distrofina care işi conserva parţial funcţia; in aceste cazuri este vorba de deleţii sau duplicaţii care juxtapun unii exoni de la nivelul cadrul de citire.

In familiile in care persoana de sex masculin afectata prezinta o deleţie sau duplicaţie DMD cunoscuta, aceasta modificare este cautata şi la rudele cu risc crescut. Absenţa modificarii exclude starea de purtator. Identificarea unei mutaţii DMD confirma starea de purtator; deoarece femeile purtatoare prezinta un risc crescut de a dezvolta cardiomiopatie, se recomanda o evaluare cardiaca completa cel puţin o data la 5 ani, dupa varsta de 25-30 ani¹.

Limite şi interferenţe

Un rezultat negativ pentru o mutaţie DMD la testul MLPA nu exclude diagnosticul la persoanele cu tablou clinic sugestiv. Avand in vedere faptul ca in 25-30% din cazurile de distrofie musculara Duchenne-Becker sunt implicate mutaţii punctiforme, se recomanda secvenţierea completa a genei DMD.

In familiile in care mutaţia DMD nu este cunoscuta, obţinerea unui rezultat negativ la testul MLPA pentru femeile cu risc crescut nu exclude starea de purtator. Prezenţa unui istoric familial pozitiv impune secvenţierea intregii gene^1;3;4.

Bibliografie