Иммунофенотипирование лимфоцитов - опухолевый иммунитет

Неопластическая трансформация клетки является первой стадией в естественной истории рака. Как только опухолевая клетка появляется, она определяет посредством последовательных делений образование клона клеток и, наконец, образование опухолевой ткани, с выражением основных характеристик злокачественного фенотипа, а именно: чрезмерной и бесконечной пролиферации, аномальной миграции и генетической нестабильности1.
У взрослых раковая опухоль является в большинстве случаев конечной стадией хронического воспаления (например, курение связано с раком легких, солнечное излучение с раком кожи), тогда как у детей оно является результатом прогрессирующей нестабильности генома, врожденной или обусловленной приобретенные генетические поражения. Опухоли у детей бедны клетками приобретенного иммунитета (Т-клетки и миелоидные дендритные клетки) 6.
Проблема истинного существования иммунологического надзора в опухолях до сих пор не решена. В то время как в случае бактерий и вирусов, которые экспрессируют множество чужеродных белков, иммунная система может эффективно распознавать и контролировать инфекцию, в случае опухолевых клеток, которые очень мало отличаются от нормальных, иммунный ответ уже не так эффективен 2.
Опухолевые антигены
В идеале, чтобы иммунная система распознала чужеродные как опухолевые, антигены должны экспрессироваться только опухолевыми клетками, а не нормальными. В действительности, большинство опухолевых антигенов слабо иммуногенны, слабо выражены и очень неоднородны. В то же время в опухолевой клетке имеются сверхэкспрессированные антигены, но они также обнаруживаются в небольших количествах в нормальных клетках 2.
Опухолевые антигены, распознаваемые эффекторными лимфоцитами, были классифицированы следующим образом:
- чужеродные для организма антигены (в частности, опухоли): молекулы, которые экспрессируют мутантные гены, вирусные онкогены, молекулы, которые демонстрируют аномальные посттрансляционные изменения (например, MUC1 - подгликозилированный муцин). В случае этих мутантных белков только несколько пептидов могут быть потенциально распознаны как чужеродные для организма.
- собственные антигены: антигены яичка, дифференцирующие антигены, которые экспрессируются только в определенных типах тканей (например, дифференцирующие антигены, экспрессируемые меланоцитами и меланоматозными клетками, участвующими в выработке меланина), антигены, сверхэкспрессируемые опухолевыми клетками, по сравнению с их нормальным состоянием (например, - тирозиназа, обычно экспрессируемая всеми меланоцитами, встречается в высоких концентрациях в меланомных клетках); тирозиназ-специфические Т-клетки, которые распознают и разрушают опухолевые клетки, могут быть обнаружены в крови пациентов с меланомой; эти Т-клетки ответственны за депигментацию кожи (витилиго) у этих пациентов, что связано с хорошим прогнозом; - антигены плода (АФП и СЕА), присутствующие в опухолях печени, гонад и различных аденокарцином, обнаруживаются в больших количествах во время развития плода, но редко экспрессируются у взрослых; эти фетальные онкогены используются в качестве маркеров прогрессирования опухоли; - HER-2 / neu, известный как c-Erb-2 (рецептор тирозинкиназы, гомологичный рецептору эпидермального фактора роста). Ответ на все эти антигены состоит из эффекторных клеток CD4 + и / или CD8 +;
Механизмы уклонения от иммунной защиты при раке
Опухолевые образования обладают свойством переноситься иммунной системой, выражая факторы, которые негативно влияют на иммунный ответ организма.
Существует ряд причин отсутствия эффективного иммунного ответа при опухолях. Каждый аутологичный белок разлагается в цитоплазме до пептидов из 9-12 аминокислот. Эти пептиды транспортируются системой, называемой «транспортер, связанный с обработкой антигена (TAP)», в эндоплазматическую сеть, где они связаны с молекулами MCH класса I и представлены CD8 + 2 T-клеткам.
В случае опухолей пептиды не всегда «вписываются» в сайт связывания на молекулах MCH класса I. Наличие дефектного механизма процессинга антигена в опухолевой клетке (например, дефицит TAP) препятствует транспортировке опухолевых пептидов в уровень эндоплазматического ретикулума и не должен быть представлен на поверхности клетки. Во многих случаях уменьшение молекул MCH класса I и II на поверхности опухолевых клеток препятствует их распознаванию Т-лимфоцитами, и, таким образом, иммунный ответ не может быть вызван 2; 6.
Опухолевые клетки нельзя считать настоящими антигенпрезентирующими клетками, поскольку в них отсутствуют важные костимулирующие молекулы, CD80 и CD86, необходимые для активации Т-клеток. В отсутствие костимуляции презентация пептидов с помощью комплекса MCH / TCR приводит к аллергии на Т-клетки. и терпимость. Некоторые опухолевые клетки также способны останавливать выработку опухолевых антигенов, предотвращая тем самым иммунный ответ. Опухоли также могут продуцировать иммунодепрессивные вещества, такие как IL-10, TGFβ (трансформирующий фактор роста бета), простагландины, и в некоторых случаях опухолевые клетки могут экспрессировать I-подобные молекулы MCH, которые взаимодействуют с ингибирующими лигандами на Т-клетках, приводя к к анергии / апоптозу клеток Т 2.
Подобно вирусам (ВИЧ, HCV), солидные опухоли характеризуются нестабильностью генома, что приводит к образованию неоэпитопов, потенциально идентифицированных молекулами MCH класса I и II 3.
В последнее десятилетие растет интерес к доминирующему механизму толерантности, опосредованному регуляторными Т-клетками - Tregs (CD4 + CD25 +), которые, по-видимому, играют важную роль в аутоактивности, аллергии, инфекциях и трансплантации, контролируя как врожденный иммунный ответ, так и приобретенный, таким образом ограничивая аутоиммунитет и иммунопатологию. Отбор этих клеток происходит естественным образом в тимусе - природных T-регуляторных клетках (nTreg), но также может быть индуцирован в периферически индуцированных клетках Treg (iTreg). Подавляющее действие клеток Treg на иммунный ответ опухоли хорошо документировано. Таким образом, исследования, проведенные на мышах, показывают, что удаление клеток Treg способствует отторжению опухолевых клеток и может даже предотвратить их развитие in vivo как у мышей, «склонных к раку», так и после лечения химическими агентами. Исследования на онкологических больных показали, что клетки Treg гораздо чаще встречаются в популяции периферических лимфоцитов, чем у здоровых людей. Также имеются сообщения о том, что повышенные уровни Treg коррелируют с прогрессирующей стадией заболевания, что приводит к прогрессированию рака. Регуляторная инфильтрация Т-клеток также присутствует на станциях метастатического ганглия, а не на тех, у которых нет метастазов 1; 3.
Эффективные механизмы иммунитета
У взрослых врожденный иммунный ответ играет роль распознавания «напряженных» клеток или непереваренного содержимого клеток, когда клетки становятся неапоптотическими или неавтофагоцитарными.
Адаптивный (приобретенный) иммунный ответ играет решающую роль, являясь богатым источником эффекторных Т-клеток CD4 и CD8, которые играют роль в распознавании аберрантных белков, которые встречаются в опухоли, и в то же время представляют источник регуляторных клеток и важные факторы, ограничение способности NK и T-клеток опосредовать эрадикацию рака 6.
Как различные типы клеток, участвующих в создании иммунного ответа положительно или отрицательно влияют на рост опухоли, показаны в следующей таблице 1:
Иммунофенотипирование лимфоцитов - профиль опухоли и рекомендации по проведению этого теста
В пределах профиля опухоли следующие подмножества лимфоцитов определяются как в процентах, так и в абсолютном значении путем определения специфических поверхностных маркеров (молекул CD):
общие Т-лимфоциты (CD3 +);
CD45RA + наивные Т-клетки, CD45RA- Т-клетки памяти;
Клетки CD31 + (резерв тимуса);
лимфоциты-помощники (CD3 + / CD4 +);
Клетки Treg (CD25 ++ / CD127-);
CD8 + T-клетки, CD8 + / CD28 + T-клетки (цитотоксические), CD8 + / CD28- T-клетки (регуляторы);
Соотношение CD4 + / CD8 +;
незрелые Т-клетки (CD4 + / CD8 +);
активированные Т-клетки (CD3 + / HLA DR +);
В-клетки (CD19 +)
NK (CD16 + / CD56 +) и NK-клетки активированы.
Тест предназначен для мониторинга иммунного статуса у пациентов с различными злокачественными новообразованиями, особенно если применяется иммуностимулирующее лечение 4.
Во время развития новообразований постоянно устанавливается статус иммунодефицита (который должен соблюдаться в динамике) различной интенсивности в зависимости от типа опухоли, стадии злокачественного процесса и защитных сил организма9.
Наивные CD4 + CD31 + T-клетки представляют собой субпопуляцию наивных CD4 + T-клеток, недавно высвободившихся из тимуса.
Статус «CD28» дифференцирует лимфоциты CD8 с цитотоксическими свойствами. Количество цитотоксических Т-клеток не дает информации об их функции, что возможно благодаря функциональным тестам (тестам на цитотоксичность) 4.
CD8 + Т-клетки могут быть разделены в соответствии с экспрессией на их поверхности костимулирующего рецептора CD28 в CD28 + (приблизительно 50% клеток CD8 +) и CD28-, каждая из двух популяций лимфоцитов имеет различные биологические и секреторные свойства.
Популяция CD28 + Т-клеток преобладает у здоровых людей и размножается при первичных вирусных инфекциях.
Наблюдалось, что CD8 + CD28-регуляторные Т-клетки почти постоянно присутствуют в инфильтрате опухолевых лимфоцитов, являясь мощным подавляющим фактором против иммунного ответа, способным посредством IL 10 ингибировать как пролиферацию Т-клеток, так и специфическую противоопухолевую цитотоксичность 3; 8.
CD8 + CD28- T-клетки присутствуют в периферической крови больных раком с более высоким процентом, чем у здоровых добровольцев.
Суперсемейство CD28 состоит из рецепторных молекул с костимулирующим действием (CD28 и индуцибельный костимулятор - ICOS) или ингибиторов (CTLA-4, PD-1 и BTLA) на Т-клетках. CD28 и CTLA-4 являются специфическими рецепторами Т-клеток, тогда как BTLA и PD-1 также экспрессируются на B-клетках, а ICOS на NK-клетках. Активация или ингибирование Т-клеток в ответ на антигенный стимул требует двух сигналов от антигенпрезентирующих клеток (АРС). Первый сигнал представлен антигеном, экспрессируемым APC в форме пептидов, связанных с молекулами MCH, которые связываются с TCR. Распознавание антигена Т-клеточными рецепторами обеспечивает специфичность ответа. Второй сигнал, костимулятор или ингибитор, обеспечивается взаимодействием определенных рецепторов Т-клеток с соответствующими лигандами на поверхности АРС. CD28 считается прототипом костимуляторного рецептора. Считается, что CD28 присутствует почти во всех CD4 + Т-клетках и только в половине CD8 + клеток. В отсутствие костимуляции сигналы от TCR могут вызывать аллергию на T-клетки. При наличии двух сигналов происходит продуцирование цитокинов (например, IL2), а также пролиферация, дифференцировка и выживание T-клеток.
Следует отметить, что и CD28, и CTLA-4 связываются с одинаковыми лигандами (CD80 и CD86) на поверхности APC. CTLA-4 ингибирует продукцию IL2 и пролиферацию Т-клеток, участвуя в индукции и поддержании толерантности 7.
Материал - венозная кровь 4.
Транспортная среда, пробирка - вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта 4.
Объем теста - 5 мл крови 4.
Стабильность образца - кровь должна поступать в лабораторию, где проводится анализ не более 24 часов, и в течение этого периода она хранится при комнатной температуре. Охлаждение образца противопоказано 4.
Причины отказа от пробы - образцы, которые превысили интервал стабильности, охлажденные или замороженные образцы 4.
Метод - проточная цитометрия 4.
Референтные значения и интерпретация результатов
Окончательный бюллетень будет содержать контрольные интервалы для подмножеств лимфоцитов, соответствующие возрасту пациента, а также интерпретацию полученных результатов 4.
Следует отметить, что на абсолютное количество популяций лимфоцитов влияет ряд биологических факторов, включая гормоны, температуру и окружающую среду. Исследования циркадных вариаций показали прогрессивное увеличение количества клеток CD4 + в течение дня, в то время как лимфоциты CD8 + и лимфоциты CD19 + B увеличиваются только в первой половине дня, без изменений в течение дня. По этой причине при выполнении последовательного мониторинга популяций лимфоцитов рекомендуется брать образцы крови в одно и то же время суток 5.
В качестве руководства мы представляем некоторые патологические модели иммунофенотипирования, связанные со злокачественными заболеваниями:
эпителиома губ (действующая): уменьшение процентных значений для общих Т-клеток (CD3 +), активированных Т-клеток (CD3 + / HLA DR +) и NK (CD16 + / CD56 +);
- шейная аденокарцинома (I - II стадия): уменьшение доли CD8 + T-клеток (возможно, цитолитических T-клеток) и, непостоянно, уменьшение NK-клеток (CD16 + / CD56 +);
- аденокарцинома молочной железы (стадия II): лимфопения, уменьшение общего количества T-клеток (CD3 +), общего B (CD19 +), уменьшение соотношения CD4 + / CD8 +, увеличение CD8 + T-клеток (возможно, супрессор T);
- легочная аденокарцинома (действующая): лимфопения, снижение общего количества Т-клеток (CD3 +), активированный Т (CD3 + / HLA DR +), непоследовательное снижение В-клеток (CD19 +) 9.
Рост регуляторных Т-клеток во время иммуностимулирующей терапии является неблагоприятным из-за их иммуносупрессивных свойств 4.
Библиография
1. AM Gallimore and AK Simon. Positive and negative influences of regulatory T cells on tumor immunity. In Oncogene (2008) 27, 5886-5893.
2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto. Tumor Immunology. In Color Atlas of Immunology .Thieme 2003, 150-154.
3. Gilberto Filaci et al. CD8+CD28-T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and cytotoxic function infiltrate human cancers. In The Journal of Immunology,2007,179,4323 – 4334
4. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на технологии работы использованы 2010. Ref Type: Catalog
5. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication
6. Michael T Lotze, Markus Y Mapara, Carl H June. Tumor immunology and immunotherapy. In Clinical Immunology. Principles and Practice, , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1181-1199
7. Raul M.Torres,John Imboden,Harry W.Schroeder Jr. Antigen receptor genes, gene products, and co-receptors. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 74-75.
8. Simona Fiorentini et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+T lzmphocytes with phenotype and function of both naïve/memory and effector cells. The Journal of Immunology,2001,166, 900 – 907
9. Voiculescu C et al. Применение иммунофенотипирования методом проточной цитометрии в иммунодиагностике и мониторинге заболеваний человека. Проточная цитометрия в клинической и экспериментальной медицине, Ed Acad Rom, Buc, 1996, 109-113.