Иммунофенотипирование лимфоцитов - хронические инфекции

Многие вирусные инфекции сохраняются неопределенно долго после острой фазы и могут иметь значительные клинические последствия. К ним относятся инфекции HBV, HCV, ВИЧ и HTLV, для которых характерны повышенные уровни постоянных антигенов, нарушение локализации иммунных клеток в тканях и нарушение функции клеток T 5.
По определению, постоянные вирусные инфекции не полностью контролируются иммунной системой хозяина. Измененная функция Т-клеток является иерархической и, по-видимому, напрямую коррелирует с антигенным уровнем; включает низкую выработку цитокинов и нарушенную пролиферативную способность до полного «истощения» Т-клеток, участвующих в иммунном ответе. Это явление контрастирует с нормальным развитием Т-клеток памяти, которые происходят в отсутствие постоянного антигена 2; 5.
Процесс «истощения» Т-клеток в результате непрерывной конфронтации с умеренными или повышенными уровнями вирусных антигенов, экспрессирующихся на многих клетках, первоначально был описан у мышей, инфицированных вирусом хориолимфоцитарного менингита, и было обнаружено, что он применим к инфекциям ВИЧ и ВГС. тот человек. До сих пор нет однозначного ответа на вопрос, является ли «истощение клеток» следствием постоянного воздействия высоких концентраций антигена или же оно является причиной неконтролируемой репликации вируса и, следовательно, увеличения антигенной нагрузки.
На молекулярном уровне «истощение» Т-клеток определяется:

• изменение сигнальных путей с помощью TCR и цитокинов;

• экспрессия ингибирующих рецепторов (PD-1, LAG-3, Tim3 и др.);

• метаболический и энергетический дефицит;

• изменение созревания / дифференциации 2.

Отсутствие IL-2-продуцирующих клеток при постоянном воздействии ВИЧ является особенно важным открытием в свете недавних исследований развития Т-клеток памяти. Таким образом, клетки памяти CD4 и CD8 можно разделить на два подтипа в соответствии с эффекторными функциями и способностью миграции: CD45RA- центральные T-клетки памяти, которые экспрессируют маркеры L-селектина (CD62L) и CCR7 и CD45RA эффекторные T-клетки памяти, которые не экспрессирует эти маркеры и не мигрирует в сайты репликации вируса в тканях. Что касается продукции цитокинов, Т-клетки центральной памяти продуцируют в основном IL-2, тогда как эффекторные T-клетки памяти продуцируют как IL-2, так и гамма-интерферон.

Постоянство антигена у ВИЧ-инфицированных лиц в фазе виремии связано с низким числом вирус-специфических центральных клеток памяти CD4 + по сравнению с индивидуумами с подавленной виремией. Аналогичные результаты были получены при хронической вирусной инфекции С. Эти исследования показывают, что хроническое воздействие антигена приводит к функциональному нарушению вирус-специфических клеток CD4. Таким образом, присутствие вирусного антигена стимулирует генерацию эффекторных клеток памяти, способных продуцировать гамма-интерферон, но обладающих сниженной пролиферативной способностью и короткой продолжительностью жизни in vivo; в то же время нарушается развитие клеток центральной памяти, которые обладают пролиферативной способностью и секретируют IL-2; в свою очередь, эффекторные клетки памяти снижают уровень антигена 1.
Исследования, описывающие функциональный дефект в вирус-специфических клетках CD4 +, могут объяснить отсутствие эффективной противовирусной функции клеток CD8 + при ВИЧ-инфекции. Для устойчивого ответа клеток CD8 + представляется необходимым, чтобы лимфоциты CD4 + обеспечивали IL-2 (на ранних стадиях хронической инфекции) и IL-21 (на поздних стадиях). Экспрессия костимулирующей молекулы CD28 + на поверхности антиген-специфических клеток CD8 +, возможно, связана с продукцией IL-2 клетками CD4 +. Другим способом, с помощью которого CD4 + T-клетки способствуют устойчивому ответу CD8 + клеток на персистирующие инфекции, является непрерывная индукция и поддержание продукции нейтрализующих антител 1; 2.
Основываясь на концепции, которая включает участие нескольких механизмов в снижении ответов CD8 + T-клеток при хронических вирусных инфекциях, появились новые возможности для иммуномодулирующих вмешательств, которые в настоящее время оцениваются.
В некоторых сообщениях задокументировано обратное изменение функции CD4 + T-клеток, выделенных от мышей, хронически инфицированных вирусом лимфоцитарного хориоменингита, от обезьян, инфицированных вирусом SIV, или от людей, инфицированных ВИЧ или HCV, путем блокирования одного или нескольких ингибиторных рецепторов. Это функциональное восстановление зависело от продолжительной культуры in vitro в присутствии соответствующих блокирующих антител и предшествовало пролиферации CD8 + T-клеток. Индукция пролиферации в присутствии блокирующих антител против PD-1 приводит к уменьшению апоптоза, а также к увеличению длины теломер и активности теломеразы, которые, по-видимому, способствуют увеличению пролиферативного потенциала и восстановлению эффекторных функций 2.
Иммунофенотипирование лимфоцитов - профиль хронических инфекций и рекомендации по выполнению этого теста
Профиль хронических инфекций включает следующие клетки, выраженные в процентах и ​​абсолютных значениях:

• количество лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов;

• общее количество Т-клеток (CD3 +);

• CD45RA + наивные Т-клетки, CD45RA- Т-клетки памяти;

• хелперные Т-клетки (CD4 +);

• наивные CD45RA + T-клетки, связанные с количеством CD4 + клеток;

• CD31 + Т-клетки;

• CD8 + T-клетки, CD8 + / CD28 + T-клетки (цитотоксические), CD8 + / CD28- T-клетки (регуляторы);

• соотношение CD4 + / CD8 +;

• незрелые Т-клетки (CD4 + / CD8 +);

• В-клетки (CD19 +);

• NK-клетки (CD16 + / CD56 +);

• активированные Т-клетки (CD3 + / HLA DR +).

Наблюдение за иммунофенотипической картиной лимфоцитов полезно при клиническом мониторинге пациентов с хроническими инфекциями в сочетании с назначенным лечением 3.
Материал - венозная кровь 3.
Транспортная среда, пробирка- вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта 3.
Объем образца - 5 мл крови 3.
Стабильность образца - кровь должна поступать в лабораторию, где проводится анализ не более 24 часов, и в течение этого периода она хранится при комнатной температуре. Охлаждение образца противопоказано3.
Причины отказа от пробы - образцы, которые превысили интервал стабильности, охлажденные или замороженные образцы 3.
Метод - проточная цитометрия 3.
Референтные значения и интерпретация результатов
Последний бюллетень будет содержать контрольные интервалы для подмножеств лимфоцитов, соответствующих возрасту пациента, а также интерпретацию полученных результатов 3.

Следует отметить, что на абсолютное количество популяций лимфоцитов влияет ряд биологических факторов, включая гормоны, температуру и окружающую среду. Исследования циркадных вариаций показали прогрессивное увеличение количества клеток CD4 + в течение дня, в то время как лимфоциты CD8 + и лимфоциты CD19 + B увеличиваются только в первой половине дня, без изменений в течение дня. По этой причине при выполнении последовательного мониторинга популяций лимфоцитов рекомендуется брать образцы крови в одно и то же время суток 4.
При хронических инфекциях обычно наблюдается гранулоцитопения, снижение лимфоцитов CD4 + и изменение соотношения CD4 / CD8.
Наивные CD4 + CD31 + T-клетки представляют собой субпопуляцию наивных CD4 + T-клеток, недавно высвободившихся из тимуса. Определение резерва тимуса с помощью наивных CD31 + T-клеток полезно для выявления причины персистирующей лимфопении. Это может быть связано с высоким «потреблением» (признаком хронической инфекции) или низким «производством». Чем выше доля CD31 + Т-клеток, тем больше способность генерировать наивные Т-лимфоциты.
Отношение наивных Т-клеток к Т-клеткам памяти уменьшается в течение жизни, так как новые ячейки памяти всегда генерируются при контакте с антигенами. При хронических инфекциях процент Т-клеток с памятью CD45RA увеличивается в результате хронической иммунной активации 3
Библиография
1. Cheryl L Day, Bruce D Walker. Progress in Defining CD4 Helper Cell Responses in Chronic Viral Infections. In J Exp Med, Vol. 198, No.12, December 2003.
2. Helge Frebel, Kirsten Richter, Annette Oxenius. How chronic viral infections impact on antigen-specific T-cell responses. In European Journal of Immunology, 2010.
3. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на технологии работы использованы 2010. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
5. Scott N. Mueller, Barry T. Immune responses to viruses. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 426-427.