Аэробный посев крови (с антибиотикограммой в зависимости от обстоятельств)

Общая информация

Гемокультура является одним из наиболее важных и деликатных методов для микробиологической лаборатории. Кровь, будучи обычно стерильной, изолирует и идентифицирует бактерии или грибы в гемокультуре, имеет важное диагностическое значение13.

Бактериемия присутствует в крови бактерий, возникающих в результате септической вспышки или поврежденной слизистой оболочки. Часто бактериемический статус лишен клинической экспрессии или сопровождается только холодом и лихорадкой, к которым могут быть добавлены симптомы и признаки, характерные для состояния, вызывающего бактериемическую разрядку.

Септицемия-это клинический термин, с помощью которого определяется важная бактериемия с нерегулярным, непредсказуемым и серьезным клиническим развитием, сопровождаемая ознобом, нерегулярной лихорадкой, токсемией, гипотонией, прострацией, полиморфной и разнообразной сыпью, тканевыми или висцеральными септическими метастазами. Тяжесть септицемического синдрома оставляет на втором плане симптоматику первичной инфекционной вспышки, которую, однако, всегда следует искать 1.

Микробы, участвующие в:

Сепсис	Золотистый стафилококк, кишечная палочка и другие энтеробактерии, коагулазо-отрицательный стафилококк( SCN), Pseudomonas spp, Streptococcus spp, анаэробные бактерии, левури
Эндокардит	Стрептококки (Streptococcus spp)., Энтерококки (Enterococcus spp.),  Стафилококки(Staphylococcus spp)
Пневмопатия	Пневмококк (Streptococcus pneumoniae), Клебсиелла пневмонии, Гемофильная палочка
Менингит	Neisseria meningitidis(Менингококк)

 

Пути попадания: 

Легочный	Пневмококк (Streptococcus pneumoniae), Клебсиелла пневмонии, Гемофильная палочка
Кожно-слизистый ( катетер, дренаж )	Стафилококки(Staphylococcus spp)
Удаление зубов	Стрептококки (Streptococcus spp)
Пищеварительная система (желчный, кишечный)	Энтеробактерии, строго анаэробные бактерии, Энтерококки (Enterococcus spp.)
Гинекология	Строго анаэробные бактерии, кишечная палочка, Энтерококки (Enterococcus spp.)
Инфекции и непроходимость мочевыводящих путей	Энтеробактерии, Энтерококки (Enterococcus spp.)

Принцип гемокультуры

Гемокультура-это качественный тест для выявления микроорганизмов, присутствующих в крови. Кровь, взятая в условиях строгой асептики, вводится во флакон для гемокультуры, состав которого способствует развитию аэробных, анаэробных и микроаэрофильных микробов 11.

Основными факторами обогащения, включенными в окружающую среду, способствующими развитию микробов, являются:

• ассоциация пептона, казеина и желатина для потребления аминокислот;
• экстракт левури для приема витаминов;
• гемины и NAD, которые обеспечивают развитие Haemophilus и способствуют росту некоторых питательных придирчивых микробов, таких как Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp и другие анаэробные;
• витамин В6, незаменимый элемент в развитии слабого стрептококка, встречающегося при эндокардите и стафилококке;
• CO2 важный элемент для роста микробов у видов: Neisseria, Brucella, Haemophilus , Streptococcus, Campylobacter.

Размножение бактерий, однако, также зависит от ряда факторов, не зависящих от условий культивирования: плотности микробов в крови, стадии их размножения, присутствия в крови некоторых ингибирующих веществ.

Взрослые бактериемии и грибки обычно развиваются с уменьшенным количеством циркулирующих микроорганизмов (от 1 до 30 UFC/мл крови). У новорожденного младенца и малыша концентрация превышает 100 UFC/мл. В целом, между тяжестью инфекции, прогнозом и концентрацией бактерий в крови существует прямо пропорциональная взаимосвязь 3.

Бактерии, захваченные во флаконе для гемокультуры, могут быть:

• интактные, свободные в плазме, в фазе активного размножения и будут продолжать быстро делиться в бульоне для гемокультуры или в фазе покоя и начнут размножаться в конце фазы задержки, соответствующей адаптации к питательной среде флакона;
• более или менее поврежденные или замаскированные действием системы антител-комплемента, антибиотиков, полиморфноядерной фагоциты или моноцитов и будет развиваться после автолиза лейкоцитов, если они останутся жизнеспособными;
• бактерии в L-формах (дефицит питательных веществ), рост которых требует адаптированной среды (гипертонической и богатой факторами роста)12.

Рост бактерий в гемокультуре может быть задержан или предотвращен, если в культуральной среде не используется антикоагулянт, поскольку микроорганизмы рискуют попасть в фибриновый сгусток. В то же время некоторые антикоагулянты могут быть токсичными по отношению к определенным патогенам, как и антибиотики, присутствующие в крови. Эти препятствия могут быть устранены, если используется полианетолсульфонат натрия (SPS), нетоксичный антикоагулянт, который способствует размножению бактерий путем нейтрализации бактерицидной активности сыворотки человека и ингибирования действия некоторых антибиотиков (стрептомицин, Канамицин, Гентамицин, Полимиксин B). SPS может играть ингибирующую роль в некоторых suse Peptostreptococcus, Neisseria, нейтрализующем эффект присутствия желатина в культуральной среде.

Полуавтоматические или автоматизированные компьютерные системы продаются для быстрого обнаружения бактерий в гемокультурах. Принципы, на которых основаны эти системы, многочисленны. Мы упоминаем только те, которые мы используем в лаборатории Synevo: прямое обнаружение производства CO2, через:

- серийное сканирование образцов газа в результате роста бактерий во флаконе для гемокультуры, как в системе BACTEC (BACTEC 9050);

- заставить культуральную жидкость (под давлением выделяемого CO2) пройти в сигнальный отсек, откуда ее можно исследовать микроскопически и субкультурно, как в OXOID SIGNAL SYSTEM9.

Рекомендации для определения

Это делается по указанию врача в определенных клинических ситуациях, таких как:

• все случаи с лихорадкой неточного происхождения, особенно если она сопровождается вызывающими воспоминания клиническими признаками инфекции;
• сепсис, септический шок;
• пациенты с острым эндокардитом;
• синдром, предполагающий о системной инфекции специфическими микробами • кишечная лихорадка, бруцеллез, лептоспироз);
• тяжелые локализованные инфекции (менингит, пневмония, внутрибрюшные нагноения).

Гемокультура дополнительно ориентирована на:

• пациентов с ослабленным иммунитетом (рак, токсикоманы);
• пациентов, которые подвергаются медицинской агрессии • катетер, диализ или хирургическое вмешательство) и испытывает лихорадочное состояние;
• в определенных ситуациях (беременная женщина, сердечный пациент, диабетик, с почечной недостаточностью, печеночной недостаточностью), когда у пациента наблюдается лихорадка неточного происхождения 8.

Подготовка пациента

Отбор проб проводится до антимикробного лечения, в соответствии с прогностической эволюцией фебрильной кривой или в то время, когда больной сигнализирует о появлении озноба. Если это невозможно, кровь будет взята непосредственно перед введением новой дозы антибиотика. Показано взятие трех прерывистых образцов в течение 24 часов; в срочном порядке темп составляет 30-60 минут6.

Собранный образец-венозная кровь, предпочтительно натощак, гиперлипемия может помешать выявлению бактериального роста в жидкой среде.

Область выбора для прокола представлена венами сгиба локтя. Процедура отбора проб соответствует нормам асептики и антисептики, необходимым для предотвращения загрязнения образца бактериями, обитающими в покровной флоре. После сбора крови образец крови объемом 10 мл, собранный в шприце, помещают в контейнер с культуральной средой Signal путем укуса его резиновой крышки в условиях строгой асептики. Флакон мягко перемешивается для его гомогенизации по массе среды. Для системы bactec сбор урожая производится в контейнере для гемокультуры по принципу вакуумных закрытых систем.

Образец маркируется и транспортируется в кратчайшие сроки от сбора материала до лаборатории при температуре до 37ºC (изотермический ящик)8.

Необходимые материалы-стерильный шприц объемом 10 мл; флакон с культуральной средой Signal8; флакон с культуральной средой (BACTEC PLUS AEROBIC/F si PLUS ANAEROBIC/F4;10;14 , BACTEC PÈDS PLUS™/F5, подходящий для педиатрических образцов и небольших объемов крови) для системы BACTEC.

Собранное количество-взрослый:10 мл; ребенок: 3-5 мл (сигнал ) и от 3-10 мл у взрослого и 1-3 мл у ребенка (BACTEC)8.

Причины отказа от образца

• немаркированные образцы;
• неправильно собранные образцы • правила антисептики не соблюдены);
• неправильная транспортировка8.

Необходимая обработка после сбора материала-сигнальная система: прикреплена камера расширения, поставляемая в том же наборе. Инкубируется при 37ºC. Продолжительность инкубации на термостате и наблюдения за образцом составляет в среднем 7 дней. Требуется более длительная инкубация у пациентов с подострым эндокардитом, в образцах, взятых при антибиотикотерапии (до 14 дней), или при отслеживании экзигентных микроорганизмов 8.

Система BACTEC: сканирует штрих-код на флаконе на считыватель штрих-кода и помещает флакон в указанное положение. Как только дверь закрывается, процесс начинается автоматически. Машина имеет емкость 50 флаконов. Он постоянно контролирует инкубированные флаконы с гемокультурой в 35oC. Флаконы постоянно перемешиваются, чтобы способствовать росту бактерий. Положительные флаконы отмечаются визуально и сигналом. Система автоматически выполняет контроль качества каждые 10 минут. Интегрированное программное обеспечение управляет данными материала2.

Метод работы

A. Для комплекта Signal-Oxoid; он состоит из:

а) контейнер с сигнальной средой; состав этой среды позволяет развивать аэробные, анаэробные и микроаэрофильные микробы, что вызывает повышение давления, обнаруженное с помощью адаптированного к флакону индикатора роста (расширительная камера);

б) расширительная камера для окружающей среды; в случае размножения бактерий и повышения давления часть смеси крови/бульона проходит в эту камеру и указывает на бактериальную активность (положительную гемокультуру)4.

Для отслеживания образцов используется классический метод:

* Макроскопически-визуальное исследование-два раза в день флаконов с гемокультурой для поиска признаков бактериального роста. Возможно, что внешний вид флакона ориентирован на бактерию, например:

а) мутность-аэробные грамотрицательные бациллы, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;

б) гемолиз-Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus spp;

в) газообразование-аэробные и анаэробные грамотрицательные бациллы;

г) коагули-золотистый стафилококк.

* Микроскопическое исследование свежего препарата и окрашенного мазка по Граму, выполненное из флакона для гемокультуры.

Упоминание: постоянное перемешивание контейнеров в течение первых 24 часов инкубации улучшает рост подавляющего большинства бактерий aerobe9; 15.

Интерпретация культур в системе сигналов

Отсутствие роста-среда в контейнере Signal остается прозрачной и не проходит мимо зеленого чердака расширительной камеры. В течение первых 6-12 часов инкубации могут быть сделаны слепые субкультуры (инокуляция на шоколадной гелозе в атмосфере CO2 при 35ºC для других 48h или в бульоне тиогликолата с ресазурином) и мазки, которые окрашиваются по Граму (микроскопическое исследование).

Контейнеры с отсутствующим ростом будут повторно заправлены и продолжены.

Положительная гемокультура – если в исследуемой крови были микробы, которые размножались в культуральной среде (положительная гемокультура), среда будет проходить в расширительную камеру и подниматься над ее зеленым Мэнсоном.

Б. Для системы BACTEC принцип работы следующий:

Благодаря метаболической активности микроорганизмы во флаконе выделяют CO2, а флаконы, содержащие активирующий маркер, который становится флуоресцентным при контакте с CO2, обнаруживают его присутствие. Фотоприемник устройства измеряет уровень флуоресценции и отправляет данные на компьютер. Измерение интерпретируется системой в соответствии с заранее запрограммированными параметрами позитивности. Компьютер идентифицирует положительный флакон, который слышно и визуально сигнализируется зажиганием лампочки. На экране дисплея устройства отображается графическое положение положительно обнаруженного флакона.

Будучи полностью автоматической системой, флаконы контролируются каждые 10 минут, что позволяет немедленно обнаруживать положительные флаконы .

Протокол мониторинга составляет 7 дней, но развитие микроорганизмов можно обнаружить после 8 часов 2;4;10;14.

C. положительные Гемокультуры обрабатываются следующим образом:

Сигнальная система: берется из нижней части расширительной камеры небольшое количество среды. Доступ в расширительную камеру осуществляется через ее верхнюю часть стерильным маневром. Этот маневр не может загрязнить содержимое контейнера Signal.

Система BACTEC: через иглу, прикрепленную к бутылке, берется количество среды, из которой выполняются мазки, и она впитывается в культуральную среду2.

Отобранная среда используется для:

а) растяжки мазков на предметных стеклах микроскопии; они исследуются после окрашивания по Граму. По отношению к результату показаний делаются повторения.

б) репикации на твердых и жидких средах в зависимости от микроскопически очевидных бактерий: гематоза-кровь/Колумбия-кровь, агар-шоколад, Левин/Макконки, Сабуро с хлорамфениколом, тиогликолатный бульон с ресазурином.

в) бляшки инкубируют, в зависимости от микроскопически очевидной бактерии, при температуре 35ºC-37ºC в условиях аэробиоза, в атмосфере с 5-7% CO2 или в анаэробиозе (gaspack +восстановительная смесь) в течение 48-72 часов. Исследуются изолированные колонии.

d) тесты, необходимые для идентификации: идентификатор каталазы, набор для идентификации стафилококка, набор для идентификации стрептококка, диски Оптохина, факторы X, V и XV, политропные среды для энтеробактерий, реакция оксидазы , тесты API ( API 20E, API 20NE, API NH и т. д.) тесты для идентификации левов. Идентификация также может быть сделана автоматически в системе Vitek.

e) тестирование чувствительности к антибиотикам или противогрибковым препаратам диффузиметрическим или автоматическим методом на Vitek9.

D. выпуск результатов

а) частичный результат через Цветной мазок грамм-согласуется и объявляется по телефону;

б) окончательный результат после выделения, идентификации бактерии и проведения антибиотикограммы или противогрибковой терапии.

Интерпретация конечного результата выполняется в соответствии с клиническим контекстом и количеством положительных флаконов по отношению к собранным 9.

Положительные гемокультуры

Они учитываются:

• несколько положительных гемокультур с патогенным микробом;

• несколько положительных гемокультур с обычным комменсальным микробом в определенном клиническом контексте;

* 1 положительная гемокультура с известными патогенными микробами (Salmonella spp);

* 1 положительный гемокультура с потенциально патогенными микробами в вызывающем клинический контекст, такими как: Streptococcus pneumoniae при пневмопатиях, энтеробактерии при инфекциях мочевыводящих путей, коагулазо-отрицательный стафилококк при катетерных инфекциях.

Они исключают:

* 1 положительная гемокультура с комменсальным микробом без клинического контекста: коагулазо-отрицательная суперинфекция стафилококка, коринебактерии, не группируемый стрептококк;

* на депрессивной иммунологической почве также учитываются эти бактерии;

* на нормальной иммунологической почве повторяется гемокультура.

Отрицательные гемокультуры

* сбор образца был сделан после антибиотикотерапии;

* сбор образца проводился поздно в ходе болезни • появляются антитела);

* недостаточное количество собранной крови;

* слишком короткое время наблюдения;

* неправильно выбранная культурная среда.

Положительные гемокультуры для нескольких видов бактерий

Если несколько видов бактерий были выделены в один флакон или из разных флаконов одного и того же пациента,они остаются в наблюдении в следующих ситуациях :

* иммуно-депрессивный больной;

* больные коматозные;

* катетер держится в течение длительного времени.

Виды бактерий, выделенные в зависимости от периода роста

* в первые 1-2 дня растут: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, энтеробактерии;

* через 3 дня они растут: не ферментирующие грамотрицательные бациллы, анаэробные бактерии;

* через 4-5 дней: Haemophilus spp и коагулазо-отрицательный стафилококк;

* в 6-7 дней: Виды Candida;

• в 9 дней: corynebacteriile9.

Границы и помехи

* антимикробное лечение, применяемое до отбора проб;

* заражение крови экзогенной флорой;

* недостаточное количество взятых крови;

* частота и время неправильно установленных урожаев;

* неправильно подобранная инкубационная и репейная среда;

* неправильное время инкубации 1;6; 12.

Библиография

1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Coagulase-negative staphylococci isolated from various skin lesions. In D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Ref Type: Journal (Full).

2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Sisteme pentru microbiologie Becton Dickinson, Sparks, Maryland 21152 USA, 1997

3. Dumitru Buiuc. Hemocultura in diagnosticul infectiei. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicala, Romania, 2 ed. 2008, 165-182.

4. Goldenbaum P., Stafford E., Talbot B. Laboratory Study of the Neutralization of Antimicrobials by Resin-Containing Blood Culture Medium, Sixth European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.

5. Hardy L., Crowther L., Goldenbaum P., Beaty S.. Sixth European Congress of Clinical MIcrobiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.

6. Joseph M.Civetta, Robert W.Taylor, Robert R. Kirby. Critical care. In Lippincott Raven ed. 1997; 28:405-412.

7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Multicenter Comparison of High Volume (10ml) nr BACTEC Plus and the Standard (5ml) nr. BACTEC System. In Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1991, 14: 111-8.

8. Kumar P.J., Clark M.L. In Clinical Medicine. Bailliere Tindall, UK, 2 ed. 1990, 710-720.

9. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

10. Levievre H., Gimenez M., Vandenesch F. and al. Multicenter Clinical Comparison of Resin-Containing Bottles with Standard Aerobic and Anaerobic Bottles for Culture of Microorganisms from Blood. In Eur.J. Clin. Microbiol. Infect.Dis., 1997, 16:669-674.

11. Loulergue J., Avril J.L., Omwanga D. Hemocultures. In Etude des produits pathologiques. Maury- Imprimeur S.A ed. 1987, 41-45.

12. Philippona A., Paul C., Nevot P. L’hemoculture. In Rev.Prat , 33:1929-38. 1983. Ref Type: Journal (Full)

13. Reimer L.G, Wilson M.L., Weinstein M.P. Update on detection of bacteriemia and fungemia. In Clin. Microbiol. Rev., 10:445-465. 1997. Ref Type: Journal (Full).

14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Advantage of Combining Resin with Lytic BACTEC Blood Culture Media. In J. Clin. Microbiol., 1997, 35(10): 2634-8

15. Weinstein M.P. Current blood culture methods and systems: clinical concepts, technology and interpretation of results. In Clin.Infect.Dis , 23:40-46. 1996. Ref Type: Journal (Full).