Болезнь фон Виллебранда тип 2В, 2М - экзон 28

Болезнь фон Виллебранда (VWD) вызвана дефицитом или ненормальностью фактора фон Виллебранда (FVW) и является наиболее распространенным наследственным геморрагическим заболеванием, распространенность которого составляет 1% в общей популяции. Эрик фон Виллебранд в 1926 году впервые охарактеризовал это заболевание как аутосомно-наследственное патологическое состояние. VWD связан с количественными недостатками (тип 1 и тип 3) или качественными аномалиями FVW (тип 2, с подтипами 2A, 2B, 2M и 2N). FVW синтезируется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах. Его ген расположен на коротком плече хромосомы 12p13.3, включает в себя ~ 178 килобаз с 52 экзонами, самый большой экзон, 28, имеет длину 1,4kb5 и кодирует белок, организованный в 4 повторяющихся домена, включая 3 "А", 3 «B», 2 «C» и 4 «D», которые служат различным функциям FVW.

Домен A1 содержит сайты связывания для GPIb тромбоцитов, ристоцетина и коллагена типа VI, домен A3 содержит сайт связывания для коллагена I и III, сайт связывания FVIII расположен в доменах D 'и D3, а домен C1 содержит последовательность RGD, способную к взаимодействие с тромбоцитами GPIIb / IIIa1; 2; 4.

VWD может быть унаследован через несколько генетических механизмов. Большинство случаев типов 1 и 2A, а также типов 2B и 2M являются аутосомно-доминантным наследованием. Типы 2N и 3, а также некоторые типы 1 и 2A наследуются аутосомно-рецессивно. Что касается аутосомно-доминантной передачи, у большинства пораженных лиц есть затронутый родитель, и каждый ребенок имеет 50% -ную вероятность наследования мутации. Для аутосомно-рецессивной передачи родители являются обязательными гетерозиготами (карьеры мутантного аллеля), как правило, бессимптомными; на момент зачатия у каждого родного брата пострадавшего человека есть 25% -ная вероятность быть затронутой, 50% -ная вероятность быть бессимптомным носителем и 25% -ная вероятность того, что он не затронут и не является носителем, и каждый ребенок затронутой особи обязательно является гетерозиготным3.

Функциональные домены гена фактора Виллебранда (FVW): а) структура гена FVW и псевдогена; б) пре-, про-FVW; в) функциональные домены и расположение вариантов типа 2.

Тип 1, характеризующийся легким или средним дефицитом FVW, является наиболее распространенной формой, ответственной за 70% случаев VWD. Большинство пациентов с VWD типа 1 имеют легкое симптоматическое заболевание. Уровень FVW низкий, при согласованном снижении FVW: Ag и FVW: RCo уровень FVIII равен или выше, чем у FVW, и присутствуют все мультимеры, если их анализ является частью оценки пациентов. Диагностические критерии включают личный и семейный анамнез геморрагических симптомов, обусловленных низкими уровнями FVW <30 МЕ / дл. К сожалению, многие факторы затрудняют диагностику VWD типа 1.

Заболевание наследуется как не полностью аутосомно-доминантная страна с изменяющимся проникновением, даже между членами одной семьи, так что может быть затронуто только 33% детей, а в некоторых случаях легкого БВ семейный анамнез может быть не положительным2; 3. Генетические локусы вне гена FVW способствуют изменению уровня FVW. Таким образом, индивидуумы группы 0 имеют на 30% более низкие уровни, чем люди с группой крови A, B или AB, с повышенной распространенностью среди людей группы 0 с немного более низкими уровнями FVW. Изменения уровня рецепторов адгезии тромбоцитов также могут модулировать тяжесть симптомов дефицита FVW2. Уровни FVW в плазме могут быть изменены гормонами щитовидной железы, эстрогеном, стрессом8.

Недавно была предложена концепция «низкого FVW», которая может применяться к пациентам с уровнем FVW ниже референтного предела, но выше немного более низкого предела. Исследования семей пациентов с диагнозом VWD типа 1 показывают, что генная связь FVW встречается реже, когда уровень FVW составляет> 30 МЕ / дл, и указывают на то, что этот уровень может быть кандидатом на нижний предел категории «низкий FvW» 2 Эти пациенты могут подвергаться повышенному риску кровотечения, не будучи классифицированы как VWD тип 14.

Исследования были проведены в семьях с VWD типа 1, которые привели к идентификации путем секвенирования 112 кандидатов мутаций, которые ответственны за начало синдрома. Кроме того, пациенты с VWD типа 1 были идентифицированы как гетерозиготные носители с VWD типа 39. Опубликованы результаты, согласно которым общая мутация Tyr1584Cys была обнаружена у 14% канадских пациентов с VWD типа 1 и, возможно, схожей долей пациентов в Великобритания4.

Мутации были обнаружены у 60-65% пациентов с VWD типа 1, с преобладанием ошибочных мутаций; мутации missens с полностью проникающей доминантной передачей часто выявляются, когда уровни FVW: Ag и FVW: RCo <25 МЕ / дл, в то время как унаследованные мутации missens с переменной пенетрантностью (доминантной неполностью), такие как Tyr1584Cys, идентифицируются при ~ 50% пациентов с FVW: Ag и FVW: RCo между 25-50 МЕ / дл.

Мутации, связанные с VWD типа 1, влияют на FVW с помощью различных механизмов, включая снижение секреции и внутриклеточную задержку из-за измененного внутриклеточного транспорта субъединиц FVW, повышенного кровообращения или, в небольшом числе случаев, снижения экспрессии белка в результате нулевого аллеля2 ; 3.

Поскольку около 50% мутаций расположены между экзонами 18-28, эти экзоны первоначально анализируются, но последовательность всего гена дает полную информацию.

Тип 3, ответственный за 1-5% случаев VWD, является наиболее тяжелой формой, обусловленной полным дефицитом синтеза FVW. Геморрагическое заболевание, как правило, диагностируется в детстве, причем часто встречаются гематомы, и гемартроз может возникать из-за низкого уровня фактора VIII, обнаруженного при этой форме заболевания. У этих пациентов уровень FVW практически не обнаруживается, а уровень FVIII, как правило, составляет 1-10 МЕ / дл, сходный с таковым при легкой и умеренной гемофилии A.
Генетический анализ выявляет гомозиготные или двойные гетерозиготные дефекты гена FVW, при этом сообщается о мутациях во всем кодирующем участке гена (экзоны 2-52), включая большие или маленькие делеции гена, мутации рамки считывания, мутации сайта сплайсинга. «innadire»), несоответствующие или бессмысленные мутации2; 4.

Полное секвенирование выявило мутации в 80-90% случаев VWD типа 3:
20% являются ошибочными мутациями, локализованными в доменах D1-D2 (экзоны 3-11) и D4-CK (экзоны 37-52);
-80% - это нулевые аллели, расположенные на уровне всего гена, которые могут быть результатом различных типов мутаций и которые не продуцируют функциональный белковый продукт3.

Мутации в структуре считывания и нонсенс, приводящие к потере экспрессии белка FVW или синтезу усеченного меченого белка FVW, были идентифицированы в семьях с VWD типа 3, причем мутация в рамке считывания на экзоне 18 ответственна за большинство случаи VWD типа 3 среди населения Швеции и распространены в Германии. Эта мутация состоит из стабильной мРНК, кодирующей усеченный белок, быстро деградирующий на клеточном уровне4.

Широкие делеции гена были выявлены в небольшом числе семей, но они представляют повышенный риск развития аллоантител к FVW после обработки концентратами FVW.

Лабораторная оценка родителей пациентов с VWD типа 3 может показать умеренный количественный дефицит FVW, но чаще они протекают бессимптомно в соответствии с аутосомно-рецессивным способом передачи VWD типа 3. Инбридинг часто встречается в семьях с этим вариантом2; 4. Тем не менее, в некоторых семействах с бессмысленными мутациями и рамками считывания были выявлены гетерозиготы с явным VWD типа 1. Мутации, которые приводят к появлению аномальных субъединиц FVW, которые доминируют в основном негативно по отношению к нормальному аллелю, могут, в частности, вызывать симптоматический БВ у гетерозигот 4

Тип 2 включает качественные типы VWD и может составлять до 20-25% случаев VWD. Тип 2 подозревается, когда тяжесть симптомов пациента является чрезмерной по сравнению с уровнями FVW и FVIII, когда существует диссонирующее снижение между FVW: Ag и FVW: RCo или FVIII или когда имеется сопутствующий дефицит FVW и тромбоцитопения. В зависимости от характера функционального дефекта тип 2 подразделяется на типы 2А, 2В, 2М и 2N2.

–Тип 2А, обнаруженный у большинства пациентов с типом 2, включает формы VWD, характеризующиеся измененным взаимодействием FVW с тромбоцитами из-за дефицита высокомолекулярных и промежуточных форм FVW (которые более эффективны при взаимодействии с GPIb и коллагеном тромбоцитов). Анализ мультимеров FVW подчеркивает относительное уменьшение форм с высокой и средней молекулярной массой. Протеолитический фрагмент 176 кДа, присутствующий у нормальных людей, заметно увеличивается у многих пациентов с VWD типа 2, этот фрагмент является результатом протеолитического расщепления в сайте Tyr1605-Met1606 ADAMTS13. Как правило, он наследуется как аутосомно-доминантная страна, созданная множеством генетических механизмов.

У некоторых пациентов изменена мультимеризация FVW (тип 2A, подгруппа 1), которые не могут синтезировать и секретировать полноразмерный FVW, при этом мутации локализуются в пропептиде FVW (ранее называвшемся IIC типа), N-концевой области зрелого белка. связано с образованием мультимеров (тип IIE) и С-концевой областью, участвующей в начальном образовании димеров (тип IID). Вторая подгруппа характеризуется быстрым катаболизмом ADAMTS13 полных мультимеров, высвобождаемых в плазму. Большинство случаев VWD типа 2 наследуются по аутосомно-доминантному типу, с редкими рецессивными формами (типы IIC и IID). Большинство мутаций сгруппированы в области экзона 28, преимущественно затрагивая домен А2, включая протеолитический сайт Tyr1605-Met1606 и, в меньшей степени, домен А1. Таким образом, этот экзон должен быть исследован в первую очередь, когда подозревается этот подтип заболевания. Arg834Trp является наиболее распространенной мутацией в vWD типа 2А, отсутствие крупных и промежуточных мультимеров является эффектом протеолиза FVW в плазме.

Мутации Missens также были зарегистрированы в экзонах 12-16 (в аутосомно-рецессивных формах) и 51-52 (как в аутосомно-доминантных, так и в рецессивных формах), которые дополнительно изучаются2; 3; 4.

–Тип 2N (ранее назывался типом Нормандии) включает мутации, которые влияют на взаимодействие FVW с FVIII, приводя к «аутосомной гемофилии», с уровнями FVIII между 5 и 30 МЕ / дл, остальные лабораторные параметры, соответственно, FVW: Ag и FVW: RCo , находясь в пределах нормы. Было идентифицировано 37 мутаций4, большинство из которых включают экзоны 18, 19 и 20, которые кодируют большую часть домена, связывающего FVIII, и значительно меньшую долю в экзонах 17 и 24-273. Этот тип наследуется по аутосомно-рецессивному типу, поэтому больные пациенты должны наследовать от своих родителей два аллеля 2N или аллель 2N от одного родителя и тип VWD 1 от другого родителя2. Большинство индивидуумов являются сложными гетерозиготами по мутации missens и мутацией, которая приводит к нулевому аллелю, реже являются сложными гетерозиготами по мутации 2 missens, и часть гомозиготна по мутации missens, в частности p.Arg854Gln, которая встречается в 1% населения европы.

Генетическое тестирование обычно не является необходимым для установления диагноза БВ, но может предоставить дополнительную информацию относительно патогенеза, реакции на лечение десмопрессином, генетического консультирования или риска образования аллоантитела2.

Генетическое тестирование особенно полезно для дифференциации 2B типа 2B, а также для диагностики VWD типа 2N, соответственно, у пациентов с легкой и умеренной гемофилией A с атипичным наследованием или с короткой выживаемостью инфузионного фактора VIII, который не вызван специфическими ингибиторами. или снижение активности FVIII у женщин без семейного анамнеза гемофилии A.
Первоначально пациенты должны быть проверены на мутации в гене FVIII, а при отсутствии экзонов FVW3 - скрининг;

Тестирование носителей у членов семьи, подверженных риску аутосомно-рецессивного VWD, возможно после выявления причинных мутаций в семье3.

Пренатальная диагностика беременностей с высоким риском (как правило, для типа 3) возможна путем анализа ДНК, извлеченной из эмбриональных клеток, полученных путем амниоцентеза через 15-18 недель беременности или из ворсин хориона на 10-12 неделе беременности, если мутация / причинные мутации в семье известны или, если мутации неизвестны, диагноз можно попытаться с помощью генетического анализа сцепления с использованием широкого набора известных полиморфизмов в гене FVW, если структура семьи достаточна, результаты можно получить быстрее чем выявление мутаций в обоих аллелях3; 4.

Собранный образец - венозная кровь6.
Контейнер для сбора - вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта6.
Собранное количество - столько, сколько позволяет вакуум6.
Причины отторжения образца - использование гепарина в качестве антикоагулянта6.
Стабильность образца - 7 дней при 2-8ºC6.
Mетод

Доступны следующие тестовые варианты:

-VWD типа 1 и 3 - полное секвенирование всех генных экзонов (частота выявления мутаций составляет 60-65% для типа 1 и 80% для типа 3);
-VWD тип 2А - секвенирование экзона 28 (можно идентифицировать 80% мутаций);
-ВВД типа 2А - секвенирование экзонов 11-16, 26, 51, 52 (остальные мутации могут быть идентифицированы);
-ВВД типа 2В, 2М - секвенирование экзона 28 (можно идентифицировать 80% мутаций);
-VWD тип 2N - секвенирование экзонов 18-20 (большинство мутаций можно идентифицировать);
-VWD тип 2N - секвенирование экзонов 17, 24-27 (остальные мутации могут быть идентифицированы) 6.

Пределы и помехи

Текущая классификация не ограничивает VWD как вызванные мутациями, расположенными в гене FVW. Оценка всего гена не может идентифицировать существование мутации в случаях очевидного VWD. Таким образом, невозможность выявления причинной мутации не исключает диагноз VWD.

Нормальные варианты гена FVW очень распространены, в настоящее время известно около 150 нормальных вариантов. Эта повышенная степень полиморфизма, а также большой размер гена и наличие частичного псевдогена (расположенного на хромосоме 22q и соответствующего экзонам 23-34) могут затруднить полную последовательность гена и интерпретацию данных3; 8. FVW распределены по всему гену, затрудняя оценку.

VWD тромбоцитов возникает в результате мутаций в GP1BA, но фенотипически представлен как VWD типа 2B.

Приобретенный синдром фон Виллебранда - это геморрагическое заболевание от легкой до умеренной степени, которое не вызывается мутацией в гене FVW, чаще всего наблюдается у людей старше 40 лет без кровотечений и связано с различными состояниями: лимфопролиферативными синдромами, парапротеинемиями, заболеваниями аутоиммунный, антифосфолипидный синдром, повышенный протеолиз FVW из-за конформационных изменений, вызванных повышенными силами трения (стеноз аорты, дефект межжелудочковой перегородки), выраженный тромбоцитоз, удаление FVW из кровообращения вследствие связывания опухолевых клеток (опухоль Вильма или некоторые заболевания лимфопрола) , снижение синтеза FVW (гипотиреоз), лекарств (вальпроевая кислота, ципрофлоксацин, гризеофульвин) 3.

Список используемой литературы
1. Кастаман Г., Тоссето А., Родегьеро Ф. «Болезнь Виллебранда». В Практическом Гемостазе и Тромбозе, О'Шоннеси Д., Макрис М., Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 53-54.
2. Фридман К., Роджерс Г. «Наследственные нарушения коагуляции». В Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11-е издание, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1392-94.
3. Гудев А., Джеймс П. «Болезнь Виллебранда». GeneReviews, NCBI Книжная полка.
4. Йонсен Дж., Гинзбург Д. «Болезнь Виллебранда». В Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1929-37.
5. Кини С., Боуэн Д., Камминг А., Энайат С., Гудев А., Хилл М. «Молекулярный анализ болезни фон Виллебранда: руководство Британской сети центров гемофилии, организация врачей, Лаборатория генетики гемофилии». Гемофилия (2008); 14: 1099–111.
6. Сыневская лаборатория. Конкретные ссылки на используемую технологию работы, 2010 год. Тип ссылки: Каталог.
7. Клиника Майо, Медицинские лаборатории Майо. Справочные лабораторные службы для организаций здравоохранения. Болезнь Виллебранда 2N (подтип Нормандия), Кровь. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Тип ссылки: Интернет-связь.
8. Онлайновое наследование Менделяна у человека, Институт генетической медицины им. МакКусика-Натанса, Медицинский факультет Университета Джона Хопкинса. «Болезнь Виллебранда».
9. Раджив К. Прути, MBBS, «Практический подход к генетическому тестированию на болезнь Виллебранда», Mayo Clinic Proceedings (May 2006) 81; 5: 679-691.