Цитохимическое исследование гликогена PAS

Цитохимия основана на микроскопическом исследовании клеточных химических компонентов: нуклеопротеинов, белков, гидратов углерода, липидов и ферментов.

Цитохимические окраски предоставляют информацию о клеточной линии и дифференцировке кроветворных клеток и играют важную роль в оценке гематологических аномалий, особенно в дифференциальной диагностике и классификации злокачественных заболеваний крови.

Один из принципов, который следует учитывать, заключается в том, что положительная реакция всегда ценна, в то время как отрицательная реакция неубедительна. Для уверенности в большинстве случаев цитохимические реакции практикуются с положительным свидетелем реакции 1;2.

– негативная ; +/- слабо позитивная ; + позитивная ;+ + интенсивно положительная.

Правильный лабораторный диагноз LAM с подтипами FAB и LAL требует подтверждения данных оптической микроскопии – морфологии и цитохимической окраски – с иммунофенотипированием, возможно, данными электронной микроскопии.

В клетках крови положительная реакция обусловлена, прежде всего, наличием цитоплазматического гликогена. Считается, что накопление гликогена является индикатором нарушения регуляции его метаболизма.

Многие клетки крови демонстрируют положительную реакцию PAS в цитоплазме. Интенсивность этой реакции и тип окрашивания варьируются в зависимости от типа клеток.1.

Реагент Шиффа представляет собой бесцветный раствор, полученный путем восстановления основного фуксина. Периодическая кислота окисляет гликолевую группу или ее производные. В результате образуется альдегид, который реагирует с реагентом Шиффа с образованием пурпурного цвета1;3.

Рекомендации по определению шага

• диагностика острого лимфобластного лейкоза (LAL) подтипы L1 и L2;
• диагностика миелодиспластического синдрома или LAM-M6 путем выделения пошагово-положительных эритробластов;
• дифференциация клеток Гоше и гистиоцитов с „синими, как море” гранулами от других типов макрофагов1.

Подготовка пациента-натощак или после приема пищи3.

Собранный образец:

а) капиллярная и/или медуллярная аспирационная кровь-мазок

б) рекомендуется одновременный сбор венозной крови для гемограммы 3.

Причины отклонения образца:

• нефиксированные мазки в течение максимум 8 часов после сбора образца;
• мазки из крови, собранной на EDTA3.

Контейнер для сбора образца

а) мазки капиллярной крови выполняются непосредственно на предметных стеклах микроскопии;

б) vacutainer с EDTA K3 (фиолетовая крышка), для гемограммы 3.

Собранное количество:

а) 3-5 мазков;

Б) 2 мл3.

Необходимая обработка после сбора образца:

Желательно, чтобы фиксация мазков производилась в течение первых 30 минут после сбора образца. Возможно, это можно сделать в течение первых 8 часов. Фиксирующая смесь: этиловый спирт 9 частей + формол 40% 1 часть. Фиксация рассчитана на 30 секунд, после чего мазки смываются струей водопроводной воды. Фиксированные мазки могут сразу окрашиваться или храниться в течение нескольких дней при комнатной температуре, вплоть до окрашивания3.

Стабильность образца:

• нефиксированные мазки стабильны максимум 8 часов при 18-30ºC;
• фиксированные мазки стабильны в течение 5 дней при температуре камеры3.

Метод-микроскопическое исследование3.

Интерпретация результатов:

Гликоген окрашен в пурпурно-красный цвет в виде гранул или диффузной форме. Положительный свидетель реакции представлен зрелым гранулоцитом.

Гранулоциты содержат гликоген в диффузной форме, начиная со стадии промиелоцита, где он выглядит розовым и растет по мере созревания. Базофилы умеренно интенсивный положительный шаг, часто показывая аморфные скопления вокруг ядра. При остром миелобластном лейкозе (лам) могут быть миелобласты с красными, мелкими или средними гранулами. В бластной фазе хронического гранулоцитарного лейкоза (LGC) бласты часто являются PAS-положительными, подобно лимфобластам при остром лимфобластном лейкозе. Промиелоциты при остром промиелоцитарном лейкозе (LAM-M3), особенно гипергранулярная форма, обычно являются положительными PAS.

Обычно небольшое количество (менее 15%) зрелых лимфоцитов может быть положительным шагом со следующими аспектами :

• 1 + редкие красные, мелкие или средние гранулы;
• 2 + умеренное количество красных, мелких или средних гранул;
•   3 + кольца красных, грубых гранул или груды аморфного материала красного цвета в цитоплазме или покрывают ядро.

При нелеченном хроническом лимфатическом лейкозе (ХЛЛ) и лейкозной фазе лимфом количество положительных лимфоидных клеток обычно значительно увеличивается, но этот результат не является окончательным.

При остром лимфобластном лейкозе (LAL) переменное количество лимфобластов может быть положительным PAS 1+,2+,3+. Положительный аспект PAS 3 + демонстрирует высокую специфичность для лимфобластов лейкемии. Лимфобласты характеризуются большой изменчивостью гликогенной активности: они являются PAS-положительными только в ~ 50% случаев LAL-L1 и L2, тогда как в LAL-L3 они постоянно отрицательны.

Повышение уровня гликогена в патологических лимфоцитах не специфично для лейкемии, а связано с повышенной метаболической активностью, которая происходит в ходе любого типа лимфоидной пролиферации 1.

Моноциты отрицательные или слабо положительные(1+). Предшественники моноцитов при остром моноцитарном лейкозе (LAM-M5) часто положительны и могут иметь большие гранулы или аморфные кучи, похожие на лейкозные лимфобласты, но обычно ограниченные цитоплазмой. При остром миеломоноцитарном лейкозе (LAM-M4) бласты, при положительном PAS, имеют мелкозернистый вид.

Нормальные предшественники эритроида являются отрицательными PAS. Проэритробласты и базофильные эритробласты эритролейкемии (LAM-M6) могут иметь зернистый вид с грубыми гранулами, расположенными вокруг ядра. Диффузный положительный аспект PAS может присутствовать в зрелых эритробластах LAM-M6 и миелодиспластическом синдроме (SMD).

Мегакариобласты, мегакариоциты и тромбоциты являются положительными шагами. Мегакариобласты в LAM-M7 имеют диффузный или гранулированный вид. 1; 4; 5.

Границы и помехи

Реакция PAS имеет небольшое значение для дифференциации LAL от других типов из-за сложной и неопределенной диагностики из-за гетерогенности лимфобласт1.

 Библиография