Антитела ENA - Иммуноблот

Системные аутоиммунные заболевания характеризуются наличием повышенных титров аутоантител к внутриклеточным белкам и нуклеиновым кислотам. Эти аутоантитела обычно называют антиядерными антителами (ANA), потому что они преимущественно направлены против ядерных антигенов, но они также включают  антицитоплазматические антитела.

Обнаружение ANA является высокочувствительным, поэтому считается лучшим скрининговым тестом на системные ревматические заболевания. Распространенность АНА при этих заболеваниях составляет от 20 до 100%. Для выявления ревматических заболеваний очень важно дифференцировать ANA 1; 5; 6. Таким образом, в настоящее время описаны две основные категории антиядерных антител:

1. Аутоантитела, которые нацелены на ДНК и гистоны в качестве антигенной мишени;
2. Аутоантитела, нацеленные на растворимые ядерные антигены (ENA).

Название ENA происходит от того факта, что эти антигены первоначально были извлечены из солевых ядер. Первые идентифицированные антитела к ENA были направлены против антигена Смита (Sm, 1966); Впоследствии были описаны другие подтипы ENA, в которые они были включены вместе с ядерными антигенами и растворимыми цитоплазматическими компонентами. Основными антигенами, используемыми в настоящее время в иммунологических лабораториях, являются: рибонуклеопротеины (RNP), Sm, SS-A / Ro, SS-B / La, Sc1-70 и Jo-1. Хотя большинство антител против ENA имеют специфические ассоциации с определенными заболеваниями, иногда могут быть значительные совпадения 7.

Антитела против U1nRNP и Sm направлены против антигенов, принадлежащих к небольшой группе рибонуклеопротеинов (snRNP). Это комплексы, состоящие из РНК с высоким содержанием уридина (U-РНК) и различных белков с молекулярной массой 9-70 кДа. Хроматография выявила 5 типов У-РНК: U1, U2, U4, U5 и U6. Частицы U-nRNP содержат 6 основных или Sm белков (B, B ', D, E, F, G), а U1-RNP дополнительно содержит специфические белки (70K, A, C). Таким образом, анти-U1 RNP-антитела реагируют с одним или несколькими специфическими белками, тогда как анти-Sm-антитела реагируют с одним или несколькими коровыми белками. Действие snRNP необходимо для удаления интронов из пред-РНК мессенджера (процесс сплайсинга), в результате чего мРНК будет экспортироваться из ядра и участвовать в процессе трансляции белков из рибосом.

Повышенные титры анти-U1 RNP-антител обнаруживаются с 95-100% распространенностью при заболевании смешанной соединительной ткани (синдром Шарпа), что является одним из диагностических критериев для этого состояния. Титр антител также коррелирует со степенью активности заболевания. Антитела против RNP против U1 также могут быть обнаружены у пациентов с СКВ (15-40%), системным склерозом и полимиозитом 1; 3.

Антитела против Sm направлены против антигена Sm, названного в честь первого идентифицированного пациента (Стефани Смит). Sm-антиген является частью группы snRNP, вовлеченной в процесс сплайсинга РНК-мессенджера. Антитела против Sm обнаруживаются у 5-40% пациентов с СКВ с высокой специфичностью (более 90%) к волчанке. Вместе с двухцепочечными анти-ДНК-антителами они могут считаться патогномоничными для этого клинического состояния и являются частью диагностических критериев ACR для SLE 4.

Антитела против SS-A (Ro) направлены против антигена, который также принадлежит к группе небольших рибонуклеопротеинов (растворимое вещество А или антиген Роберта). Он состоит из молекулы РНК (Y1, Y2, Y3, Y4 или Y5) и белка 60 кДа. Комплекс также может связать 52 кДа белок (Ro52), но это все еще спорным в литературе. Различные исследования показали, что SS-A-позитивные сыворотки всегда содержат антитела против нативного белка SS-A 60 кДа и могут дополнительно иметь антитела, направленные против белка Ro52. Дифференциация от антител против Ro52 имеет диагностическое значение, поскольку они неспецифичны и могут быть обнаружены в различных условиях.

Антитела против SS-A связаны с различными аутоиммунными заболеваниями: синдром Шегрена (40-95% случаев), СКВ (20-60%), первичный билиарный цирроз (20%). Следует отметить, что эти аутоантитела встречаются в 100% случаев волчанки новорожденных. Их также можно обнаружить при аутоиммунном или вирусном гепатите.

Антитела против SS-B (La) направлены против белка, который играет роль в транскрипции РНК-полимеразы III (растворимое вещество B или антиген Лейна). La, вероятно, является фактором завершения транскрипции, который связывается с 3'-концом вновь созданных продуктов транскрипции РНК-полимеразы III. Антитела против SS-B обычно встречаются в сочетании с антителами против SS-A и связаны с такими же клиническими состояниями1; 6; 7.

Анти-Ro52s направлены против антигена 52 кДа и были описаны как неспецифические аутоантитела, связанные как с ревматическими, так и с неревматическими заболеваниями. Они на 100% присутствуют у матерей плодов или новорожденных с врожденной атриовентрикулярной блокадой или волчанкой новорожденных 1.
Антитела против Scl-70 направлены против негистонового белка 70 кДа, первоначально выделенного из ядер клеток печени крысы. Впоследствии было показано, что этот белок является деградирующим продуктом ДНК топоизомеразы I, класса ферментов, расположенных в нуклеоплазме и ядрышках, обладающих функцией поддержания информационной целостности ДНК (благодаря способности расщеплять и объединять один из две нити ДНК).

Антитела против Scl-70 обнаруживаются у 40% пациентов с диффузным системным склерозом и у 10% пациентов с ограниченным системным склерозом, что является неблагоприятным прогностическим фактором.

Антитела против Jo-1 направлены против фермента гистидил-т-РНК-синтетазы. In vitro эти аутоантитела связываются с конформационными эпитопами фермента и ингибируют его каталитическую активность. Антиген находится в димерной форме и находится в цитоплазме; Молекулярная масса субъединиц составляет 50 кДа. Антитела против Jo-1 являются серологическим маркером дерматомиозита / полимиозита, распространенность которого составляет 20-40%. Присутствие этих аутоантител связано с более тяжелой формой заболевания, плохим прогнозом и более частыми рецидивами. Аутоантитела могут быть обнаружены на ранней стадии, иногда до появления симптомов. У детей анти-Jo-1 антитела встречаются крайне редко 1; 3; 6; 7.

Рекомендации по определению антител к ENA BLOT - оценка пациентов с положительным тестом ANA IIF (непрямой иммунофлуоресценции) и клиническими признаками, указывающими на системное ревматическое заболевание. Как правило, не рекомендуется проводить ANA при наличии отрицательного результата АНА IIF, если только у пациента нет явных клинических признаков ревматического заболевания и особенно синдрома Шегрена или полимиозит (тест АNА иногда может быть отрицательным в присутствии антител к высокорастворимым антигенам, таким как будет SS-A / Ro или против цитоплазматических антигенов, недостаточно экспрессируемых на препаратах Hep-2 или других тканях, таких как Jo-1) 5.

Подготовка пациента - натощак или после еды 2.
Материал - венозная кровь 2.
Транспортная среда, пробирка - вакуумный без антикоагулянта с / без разделительного геля 2.
Необходимая обработка после сбора материала - отделение сыворотки центрифугированием 2.
Объем образца - минимум 0,5 мл сыворотки 2.
Причины отказа от пробы - сильно гемолизированная сыворотка, липемическая или загрязненная бактериями 2.
Стабильность образца - отделенная сыворотка стабильна в течение 14 дней при 4 ° С; более длительное время при -20 ° С 2.
Метод - иммуноблот. В анализе используются 7 очищенных нативных и рекомбинантных антигенов, которые закреплены в параллельных чипах на мембране полоски.

Антигены представлены в порядке фиксации на полоске:
- nRNP / Sm: очищенный нативный антиген
- Sm: очищенный нативный антиген
- SS-A: очищенный нативный антиген
- Ro 52: рекомбинантный антиген
- SS-B :: очищенный нативный антиген
- Scl-70: очищенный нативный антиген
- Jo-1: очищенный нативный антиген

На первом этапе полоску, загруженную очищенными антигенами, инкубируют вместе с разведенной сывороткой пациента. Если в сыворотке присутствуют специфические антитела, они будут связываться с соответствующими антигенами на полоске. После стадии промывания полоску инкубируют с меченным щелочной фосфатазой человеческим анти-IgG-конъюгатом. Конъюгат будет прикрепляться к части IgG комплекса антиген-антитело. После промывки путем удаления несвязанного конъюгата добавляют окрашивающий раствор (субстрат фермента) - колориметрическую систему обнаружения фермента. Если присутствует связанный конъюгат, ферментативная реакция будет генерировать продукт темно-синего цвета в полосах, занятых специфическими антителами. Таким образом, полосы, визуализируемые на полоске, являются результатом связывания специфических антител с отдельными антигенами на полоске.

На каждой полосе имеется внутренняя контрольная полоса. Появление интенсивной цветовой реакции на этом уровне свидетельствует о том, что все этапы теста иммуноблота были выполнены правильно.

Интерпретация результатов

Окончательная интерпретация результатов теста выполняется с помощью программного обеспечения (после сканирования полос), которое в зависимости от интенсивности сигнала дает оценку для каждой полосы полосы следующим образом:

Нет группы 0-5 0 ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ
Слабая полоса 6-10 (+) Cомнительный
Средняя интенсивность 11-25 или 26-50+, ++ ПОЗИТИВНО
Очень интенсивная группа > 50 +++ ИНТЕНСИВНЫЙ ПОЗИТИВ

Наконец, подсчитывается сумма присужденных баллов и генерируется результат теста.

Положительный результат подтверждает наличие специфических антител.

Неоднозначный результат указывает на то, что присутствие аутоантител является неопределенным; В зависимости от клинического контекста пациента, тест будет повторяться каждые 1-2 месяца.

Отрицательный результат указывает на отсутствие специфических аутоантител 2.

Пределы и интерференция 2
- nRNP / Sm: отрицательный
- Sm: отрицательный
- SS-A: отрицательный
- Ro 52: отрицательный
- SS-B: отрицательный
- Scl-70: отрицательный
- Джо-1: отрицательный.

Библиография
1. Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s
Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
2. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на технологии работы использованы 2012. Ref Type: Catalog.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com 2012. Ref Type: Internet Communication.
4. Soto ME, et al. Gender impact in systemic lupus erythematosus. In Clin Exp Rheumatol 22 (2004), 713-721.
5. Tozzoli et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diiseases. In Am Clin J Pathol 2002, 117, 316-324.
6. van Venrooji WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. In J Immunol Methods 5 (1991), 181-189.
7. Yashwant Kumar et al. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. In Diagnostic Pathology, 2009, 4:1.