Спинальная мышечная атрофия (SMN1 - секвенирование)

Спинальная мышечная атрофия (AMS) представляет собой прогрессирующее нервно-мышечное заболевание с аутосомно-рецессивной передачей, характеризующееся мышечной слабостью и атрофией, вызванной дегенерацией моторных нейронов в спинном мозге и ядрах ствола мозга. Это второе наиболее распространенное наследственное заболевание после муковисцидоза, с частотой около 1 на 10 000 новорожденных для острой формы (AMS типа I) и 1 на 24 000 новорожденных для хронических форм заболевания (AMS типа II и III). В более чем 95% случаев это заболевание вызвано аномалиями гена SMN1 (Survival Motor Neuron 1), который вызывает значительный дефицит белка SMN 1; 3.

В начале 1980-х годов Вердниг и Хоффман описали расстройство, характеризующееся прогрессирующей мышечной слабостью в детском возрасте, которая привела к ранней смерти, и гистопатологически потеря нейронов в передних рогах спинного мозга.

В 1995 году был описан ген, участвующий в атрофии мышц позвоночника. Он кодирует специфический нейронный белок, нейрональный белок выживания (SMN). Заболевание вызывается мутациями, которые происходят в гене SMN1 (Survival Motor Neuron), и считается, что его серьезность модулируется генами, такими как SMN2, NAIP (белок, ингибирующий апоптоз нейронов) или PLS3 (Plastin 3). Область SMN на хромосоме 5q12.2-q13.3, состоящая примерно из 500 т.п.н., необычно сложна, с повторяющимися псевдогенными последовательностями, ретротранспозируемыми элементами, делециями, дупликациями или инверсиями. У незатронутых людей есть две копии гена SMN, расположенные в тандеме на каждой хромосоме: SMN1 (теломерная копия - telSMN, SMNt или SMNT) и SMN2 (центромерная копия - cenSMN, SMNc, BCD541 или SMNC). Оба гена содержат 9 экзонов и различаются по 8 нуклеотидам (пять интронных и три экзонических, расположенных в экзонах 6, 7 и 8). Экспрессия гена SMN1 продуцирует полноразмерный белок SMN, тогда как экспрессия SMN2 вызывает укороченную версию полипептида, в которой отсутствуют 16 аминокислот на карбоксиконце.
Люди с AMS являются либо гомозиготными по делеции экзона 7 SMN1 (Δ7 SMN1), либо составными гетерозиготами по Δ7 SMN1 и внутригенной мутации SMN1. Удаление теломерной копии SMN (SMN1) напрямую связано с AMS, поскольку отсутствие экзона 7 или экзонов 7 и 8 обнаруживается более чем у 95% больных, независимо от клинической формы проявления 3.

У пациентов с мутациями приблизительно 70-80% продукта гена SMN находится в форме усеченного белка. У всех пациентов со спинальной мышечной атрофией сохраняется по крайней мере одна копия SMN2, но она способна генерировать только 10% необходимого количества полноразмерных SMN по сравнению с SMN1. У пациентов с AMS типа I менее 9% от нормального количества полноразмерных SMN (fl-SMN), у пациентов с AMS типа II - 14%, а с AMS типа III - около 18%. При уровне SMN, составляющем 23% от нормальной концентрации, моторная функция выглядит нормальной. Бессимптомные носители обычно имеют 45-55% от нормального уровня SMN.

Также в 1995 году был идентифицирован ген NAIP, кодирующий белок NAIP (белок, ингибирующий апоптоз нейронов). Удаление этого гена, близкого к гену SMN, связано с AMS, о чем свидетельствует наличие гомозиготных мутаций в гене NAIP у 45% пациентов с AMS типа I и у 18% пациентов с AMS типа II или III.

Этот белок относится к классу высоко консервативных белков, ингибирующих апоптоз (AIP), которые помогают регулировать запрограммированную гибель клеток. Элиминация этого гена, по-видимому, связана с тяжелыми фенотипами AMS. 15% пациентов с AMS имеют мутации в гене BFT2p44 1

В зависимости от возраста начала, ожидаемой продолжительности жизни, распределения мышечной гипотонии и поэтапного моторного развития пациентов, были описаны несколько фенотипов AMS (см. Таблицу ниже), из которых наиболее важными являются: острый инфантильный тип AMS I или болезнь Верднига-Хоффмана), хроническая инфантильность (AMS тип II), хроническая ювенильная (AMS тип III или болезнь Кугельберга-Веландера) и взрослая форма (AMS тип IV). Наряду с этим также описаны: пренатальная форма (SMA 0), врожденная аксональная невропатия и спинальная мышечная атрофия, связанная с врожденным артрогрипозом 1; 3.

ОМС I (острая спинальная мышечная атрофия или болезнь Верднига-Гофмана) возникает в возрасте около 6 месяцев и характеризуется мышечной атрофией и параличом спинального происхождения. Более 95% пациентов имеют симметричную, прогрессирующую мышечную слабость и гипо- или атонию в возрасте до 3 месяцев. Гистопатологически наблюдается дегенерация моторных нейронов в передних рогах спинного мозга и в ядрах ствола мозга; симпатические волокна и пирамидальные пучки поражаются меньше.

При рождении могут наблюдаться цианоз, артрогрипоз или деформации скелета (сколиоз) и суставов в результате гипотонии, существующей с момента внутриутробной жизни.

Атрофия и паралич быстро развиваются, сначала появляются в мышцах спины, затем постепенно переходят к мышцам пояса, в конечном итоге затрагивая дистальные части конечностей. Атрофия мышц может иногда маскироваться жировой тканью, характерной для детей.

У пациентов нет экстраокулярного повреждения мышц, а слабость лицевых мышц часто минимальна или отсутствует. Поражений в сердечной мышце нет, но специфическое изменение основного электрокардиографического ритма объясняется фасцикуляцией конечностей и мышц грудной стенки.

У детей или новорожденных фасцикуляции часто ограничиваются языком и их трудно отличить от обычных случайных движений. Постуральный тремор пальцев наблюдается только при AMS I. Остеотендиновые рефлексы устраняются после повреждения периферического двигательного нейрона. Поражения луковицы появляются через несколько месяцев или несколько лет после начала заболевания, что приводит к неспособности ребенка сосать или глотать и, в конечном итоге, к дыхательной недостаточности и смерти.

Большинство людей умирают до двухлетнего возраста, но иногда люди, у которых есть клинические формы заболевания, которые начинаются клинически после 6-месячного возраста, могут дожить до подросткового или зрелого возраста.

В некоторых случаях заболевание может вызвать молниеносную мышечную слабость в первые дни жизни. Такие тяжелые проявления, связанные с ранней бульбарной дисфункцией, имеют среднюю выживаемость 5,9 месяцев. В 95% случаев дети умирают из-за осложнений заболевания в возрасте до 18 месяцев, но если они получают респираторную поддержку, они могут жить более двух лет 1; 3.

AMS типа II или хроническая мышечная атрофия позвоночника (болезнь Дубовица) является наиболее распространенной формой мышечной атрофии позвоночника. Это проявляется между 6 и 12 месяцами и развивается медленно. Симптомы начинаются с ощущения слабости в мышцах нижних конечностей и туловища. Постепенно чувство слабости усиливается, и ребенок начинает испытывать трудности при ходьбе. Мышцы верхних конечностей поражаются в меньшей степени. В результате воздействия на дыхательные мышцы дыхание становится все более и более затрудненным. Обычно мышцы гортани и жевательные мышцы не поражены.
Необычной особенностью заболевания является постуральный тремор, который поражает пальцы. Считается, что это связано с фасцикуляцией скелетных мышц.
Во время болезни могут появиться псевдогипертрофия икроножной мышцы и скелетно-мышечные деформации.

Темпы физического развития нормальные, как и развитие психических функций.

Продолжительность жизни пациентов с СМА II типа колеблется от 2 до 30 лет, причем респираторные инфекции являются основной причиной смерти 1; 3.

AMS типа III или юношеская спинальная мышечная атрофия (болезнь Вольфарта-Кугельберга-Веландера) возникает после 18 месяцев и имеет более мягкий курс, чем первые два.

Люди с AMS III могут ходить самостоятельно, но часто могут испытывать трудности при подъеме или спуске по лестнице в возрасте 2-3 лет. Нижние конечности поражены сильнее, чем руки. Прогноз обычно коррелирует с максимальной двигательной функцией. Люди с AMS III, у которых состояние началось до того, как они научились ходить, теряют способность ходить до середины подросткового возраста, в то время как люди, у которых появилась нормальная способность ходить до наступления мышечной слабости, могут сохранять эту способность до третье или четвертое десятилетие жизни.

Выделение SMN1 в области 5q11.2-13.3 в качестве определяющего заболевание гена имело важное значение для диагностики пациентов с AMS. Идентификация гомозигот с делецией экзонов 7 и 8 гена SMN1 является важным критерием для установления точного диагноза, учитывая, что примерно 95% диагностированных субъектов имеют эту мутацию. 2-5% пациентов составляют сложные гетерозиготы для делеции экзонов 7 и 8 и точечной мутации SMN1.

Многочисленные данные указывают на то, что на тяжесть заболевания также влияет количество копий гена SMN2 (которое может варьироваться от 0 до 5), поэтому установление этого числа является частью стратегии тестирования 3.

Рекомендации по генетическому тестированию
-подтверждение диагноза АМС у пострадавших лиц;
- выявление состояния носителя (гетерозиготного) путем тестирования бессимптомных взрослых с высоким риском; это заключается в определении количества копий гена SMN1, содержащего экзон 7, присутствующего в генотипе; следует отметить, что этот тест бесполезен для оценки возраста начала, тяжести, типа симптомов или того, как заболевание прогрессирует 1; 3;

-Пренатальная диагностика у беременных с высоким риском мутации SMN1; выполняется путем анализа ДНК, выделенной из эмбриональных клеток, полученных амниоцентезом, обычно выполняемым примерно через 15-18 недель беременности или биопсией ворсин хориона, примерно через 10-12 недель беременности; мутации, вызывающие заболевание, должны быть выявлены до пренатального тестирования 1; 3.

Материал - венозная кровь 2.
Транспортная среда, пробирка - вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта 2.
Объем образца - 5 мл крови 2.
Причины отторжения образца - использование гепарина в качестве антикоагулянта; коагулированные или гемолизированные образцы 2.
Стабильность образца - 7 дней при 2-8ºC 2.
Методы - доступно несколько методов тестирования:

1) анализ делеций / дупликаций MLPA для выявления делеций экзонов 7 и 8 гена SMN1;
2) секвенирование всего гена SMN1 для выявления внутригенных мутаций;
3) Количественная ПЦР для определения количества копий гена SMN2;
4) Анализ генного анализа на основе ПЦР для определения количества копий гена SMN1 и выявления бессимптомного статуса носителя

Мутации, обнаруженные в гене SMN1 и соответствующем генотипе 1, будут сообщены.

Не существует корреляции между удалением экзонов 7 и 8 SMN1 и тяжестью заболевания. Исследования показывают, что наличие трех или более копий гена SMN2 коррелирует с менее тяжелым фенотипом заболевания. Таким образом, было обнаружено, что некоторые люди, гомозиготные по делециям SMN1, имеющие 5 копий гена SMN2, являются бессимптомными; по этой причине считается, что наличие 5 копий SMN2 может компенсировать отсутствие гена SMN1.

Поскольку AMS передается аутосомно-рецессивно, при зачатии у каждого родного брата пострадавшего человека есть шанс 25% быть носителем и представлять с условием, 50% шанс быть бессимптомным носителем и 25% шанс не быть носителем и не быть затронутым.

Около 98% родителей больного ребенка являются гетерозиготными и, следовательно, имеют вызывающую заболевание мутацию в гене SMN1, остальные 2% не являются носителями мутации, и генетические аномалии их детей возникают снова.

Секвенирование не может определить, находится ли точечная мутация в гене SMN1 или SMN2, за исключением случаев, когда один из этих двух генов отсутствует. Идентификация ранее сообщенной мутации более чем у одного человека, пораженного этим заболеванием, доказывает, что мутация локализована в гене SMN1.
До 4% от общей популяции имеют два гена SMN1 в одной хромосоме. В такой ситуации анализ дозы гена не сможет выявить бессимптомного носителя заболевания 3

Библиография
1. Bryan Tsao, Carmel Armon. Spinal Muscular Atrophy. www.emedicine.medscape.com, Ref Type: Internet Communication.
2. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на технологии работы использованы 2010. Ref Type: Catalog.
3. Thomas W Prior, Barry S Russman, Spinal Muscular Atrophy, Gene Reviews, 2006. www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type: Internet Communication