Bursttest (окислительный взрыв нейтрофила)

Нейтрофилы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе, особенно в антибактериальной резистентности, в качестве эффекторных, индуцирующих и регуляторных клеток.

Среди их существенных особенностей:

• маргинализация и адгезия к эндотелиальным клеткам сосудов;
• пересечение сосудистой стенки (диапедез) и миграция в очаги воспаления;
• распознавание и фагоцитоз опсонизированных молекул;
• разрушение и разрушение этих молекул в результате образования токсичных кислородных радикалов.

Этим особенностям способствует присутствие рецепторов на поверхности и внутри клеток, таких как рецепторы цитокинов, нейротрансмиттеры, аутокоиды и гормоны.
Нейтрофильный хемотаксизм возникает в ответ на хемотаксические факторы (хемотаксины), генерируемые в очаге поражения. Кроме того, хемотаксины усиливают метаболизм нейтрофилов, их агрегацию и бактерицидное действие.

Фагоцитоз опосредуется циркулирующими опсонинами, специфическими (иммуноглобулины IgG) или неспецифическими (компоненты комплемента), нейтрофилами, имеющими рецепторы для фрагмента Fc иммуноглобулинов IgG1, IgG2 и для фрагмента комплемента iC3b (инактивированный C3b). Поглощенные и опсонизированные микроорганизмы уничтожаются как кислородзависимыми, так и независимыми от кислорода механизмами. Свободные радикалы кислорода разлагают бактерии, поглощенные фагосомами, и частично высвобождаются в окружающую среду, где они усиливают разрушение микроорганизмов и одновременно вызывают повреждение тканей. Процесс характерен для острого воспаления, гораздо реже при хронических воспалительных заболеваниях. Разрушение микроорганизмов также может происходить через белки, присутствующие в азурофильных грануляциях, такие как катепсин G, лизоцим, интерфероны и т.д.

Медиаторы воспаления, цитокины (например, TNFα) и селектины увеличивают способность гранулоцитов локализоваться в месте воспаления. Способность к фагоцитозу увеличивается за счет усиления выработки кислородных радикалов и высвобождения лизосомальных ферментов. TNFα является важным фактором, который усиливает фагоцитарную и цитотоксическую активность нейтрофилов. В свою очередь, активированные гранулоциты секретируют цитокины; IL-1, который стимулирует выработку IL-8 моноцитами, эндотелиальными клетками и фибробластами, увеличивает экспрессию молекул адгезии CD11b / CD18 и образование радикалов кислорода. Гамма-интерферон является мощным цитокином, который усиливает экспрессию Fc-рецепторов, стимулирует изменения кислорода, а также высвобождение гранул из нейтрофилов1.

Благодаря упомянутым характеристикам гранулоциты участвуют в раннем воспалительном ответе, и их функциональные аномалии, возникающие на любом из этапов, определяют значительные недостатки клеточного иммунитета5.

Снижение или отсутствие активности генерации окислительного взрыва в нейтрофилах или моноцитах обнаруживается при некоторых наследственных дефектах, таких как хроническое гранулематозное заболевание (ХГБ). CGD представляет собой гетерогенную группу Х-связанных или аутосомно-рецессивных заболеваний, основанную на множественных генетических мутациях. В результате этих аномалий затрагивается одна из четырех субъединиц фермента NADPH оксидазы, который катализирует образование перекиси водорода. Процесс фагоцитоза протекает нормально, но окислительный метаболизм нарушается - молекулярный кислород больше не восстанавливается до супероксидного аниона и других свободных радикалов (гидроксильный радикал и перекись водорода), которые являются важными компонентами внутриклеточного механизма уничтожения бактерий.

Пациенты с CGD имеют рецидивирующие инфекции с продуцирующими каталазу микроорганизмами, такими как Staphylococcus aureus, которые способны разрушать перекись кислорода, генерируемую нейтрофилами. Эти микроорганизмы выживают при внутриклеточном проглатывании, размножаются и вызывают гранулематозную реакцию со стороны тканей, которая при чрезмерном количестве может препятствовать желудочно-кишечному и мочеполовому тракту. Другими органами, которые могут быть затронуты гранулемами, являются легкие, лимфатические узлы, печень, кости. Особенно проблематичны хронические инфекции с видами Serratia, Klebsiella, Burkholderia cepacia и Aspergillus. Следует отметить, что пациенты с ХГБ не страдают от инфекций с каталазо-негативными микроорганизмами. Начало заболевания обычно происходит в первые два года жизни2; 3; 4.

Окислительный взрыв нейтрофилов может быть затронут как у пациентов с трансплантацией, так и у больных СПИДом. Некоторые иммуномодуляторы (цитокины: GM-CSF, G-CSF, TNFα) могут оказывать некоторое влияние на клеточный окислительный метаболизм4.

Основная характеристика нейтрофилов при ХГП заключается в том, что после стимуляции они не способны произвести значительный окислительный взрыв. Классический метод скрининга на это состояние использует краситель - нитрат синего тетразола (нитроблюум тетразолий - тест NTB), который инкубируют с стимулированными нейтрофилами пациента; функциональные нейтрофилы фагоцитоз, уменьшают и осаждают желтый краситель NTB, что приводит к внутриклеточным отложениям черно-синего формазана; эти отложения представляют собой показатель внутриклеточного образования перекиси водорода; После микроскопического исследования проводится оценка нейтрофилов, содержащих внутриклеточные отложения формазана3.

В нашей лаборатории тест NBT был заменен на Burstest, который использует проточную цитометрию для оценки измененного окислительного метаболизма CGD-нейтрофилов или других состояний и для изучения эффекта иммуномодулирующих препаратов4.

Подготовка пациентов - избегайте отбора проб во время острой инфекции4.
Собранный образец - венозная кровь4.
Контейнер для сбора образца - вакутейнер с гепаринатом лития4.
Объем теста - минимум 10 мл гепаринизированной крови4.
Стабильность образца - кровь должна поступать в лабораторию, где проводится анализ не более 24 часов, и в течение этого периода она хранится при комнатной температуре. Охлаждение образца противопоказано4.
Причины отклонения образца - образцы, которые превысили интервал стабильности, охлажденные или замороженные образцы4.
Метод - проточная цитометрия.

Бурстест позволяет количественно оценить окислительный взрыв в нейтрофилах и моноцитах. Опонизированные бактерии без метки (E.coli) используются в качестве стимулирующих частиц, лиганд протеинкиназы C (PMA - Forbol12-миристат-13-ацетат) в качестве сильного, независимого от рецептора стимула и хемотаксический пептид N-формил-MetLeuPhe (fMLP) в качестве слабого физиологического стимула. , Гепаринизированную кровь пациента инкубируют с упомянутыми раздражителями при 37 ° С; также используется тест с отрицательной контрольной ролью, который не инкубируется со стимулами; после стимуляции нейтрофилы и моноциты продуцируют активные формы кислорода, которые уничтожают бактерии внутри фагосомы; образование этих соединений контролируют путем добавления флуорогенного субстрата - дигидрородамина (DHR), который после окисления будет генерировать флуоресцентные внутриклеточные продукты, обнаруженные позднее методом проточной цитометрии; реакцию останавливают, добавляя раствор для лизиса, который удаляет эритроциты и вызывает частичную фиксацию лейкоцитов; окрашивающий раствор ДНК, добавляемый перед анализом методом проточной цитометрии, исключает артефакты, генерируемые бактериальными агрегатами, которые обладают лейкоцитоподобными светорассеивающими свойствами; используется аргоновый лазер (488 нм, синий свет); для каждого образца 10 000 000 000 лейкоцитов собирают путем стробирования; анализируются как процент клеток (нейтрофилов и моноцитов), которые продуцировали активные формы кислорода (рекрутинг), так и средняя интенсивность их флуоресценции (активность, количество расщепленного субстрата); с этой целью будет проведено «стробирование» соответствующей группы лейкоцитов и проанализирована гистограмма зеленой флуоресценции (FL1); при использовании отрицательного контроля маркер флуоресценции-1 (FL1) будет установлен таким образом, чтобы менее 1% событий были положительными; процент клеток, которые продуцируют активные формы кислорода, может быть затем определен путем подсчета событий, расположенных над маркером; средняя интенсивность флуоресценции коррелирует с количеством продуктов, генерируемых одним лейкоцитом4.

Справочные значения и передача результатов

Сообщаются следующие параметры:

Процент нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода:> 84%
Нейтрофильная окислительная активность:> 550 мФИ
mfi = средняя интенсивность флуоресценции4.

Ограничение

Образцы с количеством лейкоцитов вне контрольного диапазона требуют коррекции количества добавленных бактерий4.

Список используемой литературы
1. Анатолий Панасюк, Иоланта Высока, Эльзбета Мачёрковская, Божена Панасюк, Данута Прокопович, Януш Зак, Кароль Радомски. Фагоцитарная и окислительная взрывная активность нейтрофилов в конечной стадии цирроза печени. В Мировом Журнале Гастроэнтерологии 2005; 11 (48): 7661-7665.
2. Франческо Дати и Эрвин Метцманн. Иммунодефициты: характеристики и результаты лабораторных исследований. Лаборатория испытаний и клинического использования белков, Media Print Taunusdruck GmbH, Франкфурт-на-Майне; 2005,187.
3. Кимберли В. Сэнфорд, Сьюзен Д. Розефф. Расстройства иммунодефицита. В «Клинической диагностике и ведении Генри лабораторными методами», Saunders-Elsevier, 21-е издание, 911.
4. Лаборатория Synevo. Конкретные ссылки на используемые технологии работы 2011 года. Тип ссылки: Каталог.
5. Роджер С. Райли, Джонатан Бен-Эзра. Лабораторная оценка клеточной иммунной системы. В «Клинической диагностике и ведении Генри лабораторными методами», Сондерс-Эльзевир, 21-е издание, 826-830