ДНК Хламидии (Chlamydia trachomatis) + ДНК гонорея (N. gonorrhoeae) - моча (мужчины)

Инфекции Chlamydia trachomatis (CT) и Neisseria gonorrheae (GC) являются двумя наиболее распространенными венерическими заболеваниями в мире. Учитывая только Соединенные Штаты, Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) сообщили в 2010 году 1 307 893 новых случаев инфекции Chlamydia trachomatis и 309 341 новых случаев инфекции Neisseria gonorrhoeae1.

Хламидия - это очень маленькая грамотрицательная бактерия, обязательно внутриклеточная из-за того, что она не может синтезировать свою АТФ, будучи культивируемой только в живых эукариотических клетках (яйца с эмбрионами или клеточные культуры).

Последние классификации делят хламидиоз на 4 семейства, из которых наиболее важной в патологии человека является семейство Chlamydiaceae, которое содержит два рода:

• род Chlamydia - наиболее важным представителем является C. trachomatis;
• род Chlamydophila - C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus и др.

Chlamydia trachomatis встречается почти исключительно у людей. Описано 15 сероваров, вовлеченных в различные инфекции, причем серовары D и K являются основными причинами хламидийной инфекции у женщин и мужчин2;

Для инфекции Chlamydia trachomatis наиболее пораженной возрастной группой является 15-25 лет, распространенность инфекции составляет от 2 до 25%.

Инкубационный период заболевания обычно варьируется от 1 до 3 недель, достигая в некоторых случаях 6 недель. Большая доля инфекций развивается бессимптомно: 75% инфекций у женщин и 50% инфекций у мужчин. В симптоматических случаях уретрит и проктит могут встречаться у мужчин в острой фазе; При отсутствии лечения может возникнуть хронический эпидидимит, простатит и реактивный артрит. Клинические проявления у женщин состоят из уретрита, цервицита и бартолинита, которые могут осложняться: эндометритом, сальпингитом, пельвиперитонитом, перигепатитом и реактивным артритом.

Бессимптомная природа многих инфекций Chlamydia trachomatis ответственна за их недиагностику с важными последствиями, особенно у женщин, из-за доказанной корреляции между нелеченной инфекцией и осложнениями, такими как внематочная беременность и бесплодие. Будучи венерическим заболеванием, оценка партнеров обязательна для предотвращения повторных инфекций.

Как и в случае других венерических заболеваний, инфекция Chlamydia trachomatis может способствовать передаче ВИЧ-инфекции. Кроме того, новорожденные могут заразиться при прохождении через цервикальный канал и развить конъюнктивит, фарингит и пневмонию4;

Лабораторная диагностика инфекций Chlamydia trachomatis включает в себя выделение возбудителя в клеточных культурах, обнаружение антигена методами прямой иммунофлуоресценции (DFA) или иммуноферментными методами, а также определение бактериального генетического материала с помощью молекулярных методов. Поскольку клеточные культуры трудоемки и требуют много времени, они не используются регулярно, что является прерогативой специальных лабораторий. Более того, согласно литературным данным, разработка технологий амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) значительно улучшила клиническую чувствительность обнаружения КТ, так что выделение этого патогена в клеточных культурах больше не считается методом «золотого стандарта».

В настоящее время в США большинство программ скрининга и лабораторных испытаний основаны на этой технологии4;

Neisseria gonorrhoeae, грамотрицательный диплококк, является этиологическим агентом гонореи, одного из наиболее распространенных венерических заболеваний. У мужчин инфекция в большинстве случаев симптоматическая и связана с передним уретритом, сопровождающимся гнойной секрецией. Инкубационный период составляет 1-10 дней. У женщин основным местом заражения является эндоцервикс. Это описывает увеличенную распространенность сопутствующих инфекций с Chlamydia trachomatis и Trichomonas vaginalis, а также связь с бактериальным вагинозом. Многие женщины остаются бессимптомными и поэтому не обращаются к врачу. Когда появляются клинические проявления, они представлены измененными выделениями из влагалища, дизурией, диспареунией, межменструальным кровотечением. Другими возможными локализациями гонококковой инфекции являются прямая кишка, глотка, конъюнктива; Распространенные инфекции могут возникать редко. Дети, рожденные от инфицированных матерей, могут иметь конъюнктивит.

При отсутствии адекватного лечения антибиотиками могут развиться острые или поздние осложнения, такие как: эпидидимит или простатит у мужчин; воспалительные заболевания органов малого таза, перигепатит, бесплодие, внематочная беременность у женщин4;

N. gonorrhoeae - это лабильный микроб, который не выживает в образцах, которые собираются вне лаборатории. По этой причине микробиологическая диагностика на основе культуры в этих случаях имеет низкое значение. Как и в случае с КТ-инфекциями, разработка технологий NAAT позволила улучшить обнаружение гонококковых инфекций, и эти методы, очевидно, имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими методами культивирования:

• поскольку бактериальная ДНК обнаружена, микроорганизму не обязательно быть жизнеспособным;
• имеет более высокую чувствительность;
• у мужчин тест может быть выполнен с мочой, что повышает соблюдение пациентом режима исследования7.

В качестве заключения к вышеупомянутым Chlamydia trachomatis (CT) и Neisseria gonorrhoeae (GC) являются патогенами, наиболее часто вовлеченными в венерические заболевания, вызываемые бактериями. Важно отметить, что ко-инфекция CT-GC регистрируется примерно в 30% случаев (чаще у женщин), следовательно, необходимо комбинированное тестирование двух патогенов.

Ранняя диагностика инфекций является сложной задачей, потому что у значительной части пораженных людей нет никаких симптомов. При отсутствии диагноза и лечения они могут привести к диссеминированным инфекциям у мужчин и воспалительным заболеваниям таза у женщин со значительными поздними последствиями: бесплодие, внематочная беременность, хроническая тазовая боль5; 8. При обеих инфекциях возможна перинатальная передача при развитии конъюнктивита у новорожденного. КТ и ГК также связаны с повышенным риском передачи ВИЧ. Одним из лучших способов предотвращения осложнений КТ и ГК-инфекций является обследование подростков и молодых людей, а также беременных женщин. Если у человека диагностирована одна или обе инфекции, все сексуальные партнеры должны пройти тестирование и пройти соответствующее лечение.

Руководства CDC (Центры по контролю и профилактике заболеваний) рекомендуют проводить скрининг с помощью тестов амплификации нуклеиновых кислот с высокой чувствительностью и специфичностью, подтверждая, что молекулярные методы в настоящее время являются диагностическим стандартом для инфекций CT и GC4.
Доступные в настоящее время методы, основанные на технологии NAAT, включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), CSF (лигазная цепная реакция), CSA (амплификация смещения цепей) и TMA (транскрипционно-опосредованная амплификация) 8. Растущее использование технологии NAAT для обнаружения КТ и НГ показало, что, как уже упоминалось выше, многие половые инфекции протекают бессимптомно9.

В нашей лаборатории мы используем автоматизированный метод ТМА, который, в отличие от других упомянутых методов, основанных на амплификации бактериальной ДНК, усиливает рибосомную РНК (рРНК). Тест APTIMA COMBO 2 позволяет одновременно качественно определять КТ и ГХ, а также предлагает новый молекулярный подход, комбинируя технологии «захват цели», TMA («Транскрипционно-опосредованное усиление») и DKA («Двойной кинетический анализ»). Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими методами NAAT является то, что он нацелен на молекулы рРНК, которые присутствуют в клетках в большем количестве по сравнению с молекулами ДНК, что приводит к повышению чувствительности, что снижает риск ложноотрицательные результаты.

Принцип метода:
Тест включает в себя 3 этапа:

• Захватить цель
• усиление
• обнаружение

Образцы собираются и переносятся в соответствующие транспортные пробирки. Растворы в этих пробирках высвобождают молекулы рРНК и защищают их от деградации во время хранения.

Захват рРНК - молекулы-мишени - осуществляется с помощью захвата олигонуклеотидов, которые связываются с другими нуклеотидами, присутствующими на поверхности магнитных микрочастиц. Захватывающие олигомеры используют последовательности, комплементарные определенным участкам молекулы-мишени, которые присоединяются к ним во время стадии гибридизации. Образованные таким образом комплексы магнитно разделяют и несколько раз промывают для удаления веществ, которые могут мешать или ингибировать последующую реакцию амплификации, таким образом снижая риск ложноотрицательных результатов.

Реакция амплификации основана на способности комплементарных праймеров (олигонуклеотидов) специфически связываться и облегчать ферментативную амплификацию. Анализ APTIMA позволяет реплицировать специфическую последовательность из 23S-области рРНК для CT и 16S для GC. Для каждой молекулы-мишени используется уникальный набор праймеров. В реакции TMA используются два фермента - РНК-полимераза и обратная транскриптаза - амплификация проводится в изотермических условиях, в отличие от методов ПЦР. На первой стадии процесса ТМА промоторный праймер гибридизуется с рибосомной РНК-мишенью. Обратная транскриптаза распознает эту последовательность промотора праймера и создает ДНК-копию РНК-мишени (кДНК, комплементарная ДНК). Последовательность РНК в гибриде ДНК: РНК будет затем удалена активностью обратной транскриптазы РНКазы H. Второй праймер связывается с молекулой кДНК, и обратная транскриптаза синтезирует новую цепь ДНК, в результате чего образуется двухцепочечная молекула ДНК.

РНК-полимераза распознает промоторную последовательность в цепи ДНК и инициирует транскрипцию (процесс образования РНК в ДНК). Весь этот процесс повторяется, образуя миллионы РНК-ампликонов всего за 60 минут.

Третий этап - обнаружение ампликонов. После амплификации в реакцию вводят ДНК-зонд, меченный эфирами акридиния. Если ампликон-мишень присутствует, зонд гибридизуется и образуется стабильный комплекс зонд-ампликон. Затем добавляется реагент для отбора, который удаляет несвязанные молекулы акридиния. Следующим этапом является гидролиз молекул эфира акридиния, связанных с ампликон-зондовыми комплексами, и получение светового сигнала. На этапе обнаружения свет, испускаемый этими гибридами, измеряется люминометром в виде фотонных сигналов и сообщается в RLU (относительные световые единицы).
Для каждой из двух мишеней рРНК будет использоваться ДНК-зонд, меченный различными эфирами акридиума. Благодаря технологии DKA различия между кинетическими профилями зондов CT и GC позволяют различать сигнал, обнаруженный хемилюминесценцией. Результаты испытаний устанавливаются с использованием отсечки на основе общего значения RLU и типа обнаруженной кинетической кривой6.

Характеристики и преимущества теста APTIMA Combo 2

Рабочие характеристики теста APTIMA Combo 2 были установлены после многоцентрового исследования, проведенного в Северной Америке, которое включало 2932 пробы мочи и генитальные пробы, собранные на тампоне у лиц с симптомами и без симптомов (1569 женщин и 1363 мужчины).

В случае образцов, собранных на эндоцервикальном буфере, сообщалось следующее:
Для КТ: чувствительность 94,2%, специфичность 97,6%
Для ГХ: чувствительность 99,2%, специфичность 99,6%

и при использовании образцов мочи у мужчин:
Для КТ: чувствительность 97,9%, специфичность 98,5%
Для ГХ: чувствительность 98,5%, специфичность 99,6 %6.

Метод TMA обладает самой высокой чувствительностью из всех методов, основанных на технологии NAAT, и способен обнаруживать очень небольшое количество нуклеиновых кислот в образце. Чувствительность теста APTIMA Combo 2, проведенного на большом количестве образцов (1304 пробы мочи и генитальных проб, собранных на тампоне), оказалась явно выше чувствительности определения культуры клеток или метода DFA9. Это также единственная методика, в которой было показано, что чувствительность теста мочи эквивалентна чувствительности теста, проведенного на пробе мазка10.

Метод идентификации CT / GC, запатентованный компанией GenProbe (США), позволяет на первом этапе захватывать рибосомные молекулы РНК с помощью магнитных шариков, затем их усиление и обнаружение полученного сигнала, используя технику DKA, которая включает другая кинетика испускания и захвата света соответственно. Весь процесс, который происходит после ввода первичной трубки в анализатор, выполняется полностью автоматически, что позволяет избежать возможного загрязнения или ошибок, вносимых пользователем. Из-за этапов промывки, включенных в начале аналитического процесса, возможность получения ложноотрицательных результатов из-за ингибиторов или мешающих факторов (хорионический гонадотропин человека, кристаллы, нитриты, гемоглобин) практически исключена. Кроме того, этот метод устраняет перекрестную реактивность с другими микроорганизмами, которые могут присутствовать в мочеполовом тракте в качестве возможной потери бактериальной ДНК во время процесса экстракции, что может повлиять на реакцию амплификации и привести к ложноотрицательным результатам9.

Эффективность теста APTIMA Combo 2 была также подтверждена для обнаружения мутантных штаммов Chlamydia trachomatis, результаты подтверждают, что тест способен идентифицировать вариант шведского СТ, который имеет делецию в загадочной плазмиде, и что некоторые коммерческие тесты не обнаруживают11.

Все эти данные подтверждают точность теста APTIMA Combo 2 и рекламируют его как элитный тест в молекулярной диагностике.

В нашей лаборатории в качестве пробы у женщин используются образцы эндоцервикального тампона, а у мужчин - первая струя мочи. Как упоминалось выше, тестирование образцов мочи имеет очень хорошую чувствительность и специфичность, что представляет собой неинвазивную альтернативу анализу образцов уретры6.

Рекомендации по определению Chlamydia trachomatis - диагностика острых урогенитальных инфекций, скрининг инфекций у лиц высокого риска; скрининг беременных женщин в первом триместре беременности (для беременных женщин ≤ 25 лет и для лиц с высоким риском развития инфекций КТ и НГ тест будет повторен в третьем триместре; в случае беременных женщин, которые получили положительный результат в первом триместре беременности) будет повторяться через 3-6 месяцев) 4; 7.
Взятые образцы - образцы будут взяты из мочеполовой системы: эндоцервикальный мазок для женщин и первая реактивная моча для мужчин; для женщин будут использоваться тампоны, включенные в системы сбора, предоставляемые лабораторией (см. рисунок 1).

Коллекция эндоцервикальных проб

Перед фактическим сбором избыток слизи будет удален из отверстия шеи с помощью тампона из белой палочки, включенного в набор (APTIMA CLEANING SWAB); затем вставьте другой тампон с синим стержнем (APTIMA COLLECTION SWAB) в цервикальный канал, осторожно поверните 5 раз в одном направлении (10-30 секунд), затем слегка втяните, избегайте контакта со слизистой влагалища и будет вставлен в транспортную трубку; тампон сломается около отметки, так что только конец тампона останется в транспортной трубке, плотно прилегающей к крышке. Трубка будет надлежащим образом маркирована и отправлена ​​в лабораторию. Не прикасайтесь к крышке алюминиевой фольги трубки.

Каждый образец будет упакован отдельно в специальные оранжевые пакеты.

Сбор образцов мочи

До фактического сбора пациент не должен мочиться не менее 1 часа; затем его собирают в одноразовый контейнер с плотно прилегающей крышкой (например, 24-часовой писсуар, предоставленный лабораторией) примерно в 20-30 мл первого потока мочи.

В течение 24 часов после сбора приблизительно 2 мл образца мочи, собранного пациентом, будет перенесено в транспортную трубку на изображении ниже. До тех пор образец будет храниться при 2-30ºC.

Перенос образца в транспортную пробирку будет выполняться в лаборатории с использованием пластиковой пипетки из набора. Если образцы не могут добраться до лаборатории в течение 24 часов, сотрудники Synevo запросят транспортные пробирки, чтобы перенести образцы в соответствующие места.

Для обеспечения правильного объема мочи уровень жидкости должен находиться между двумя черными линиями, отмеченными стрелками на этикетке пробирки. Трубка будет запечатана и правильно маркирована. Для хорошей гомогенизации мочи со стабилизирующей средой в пробирке, 5 инверсионных движений пробирки будут выполнены, не касаясь крышки алюминиевой фольги пробирки.

Каждый образец будет упакован отдельно в специальные оранжевые пакеты.

Стабильность образца - 2 месяца при температуре 2-30ºC для эндоцервикальных образцов и для стабилизированных образцов мочи (переносится в пробирку) 6.
Метод - ТМА (транскрипционно-опосредованная амплификация); используются следующие типы контролей: положительный контроль CT / отрицательный контроль GC и положительный контроль GC / отрицательный контроль CT6.
Пределы обнаружения
Сообщается об аналитической чувствительности 1 IFU / тест (7,25 IFU / буфер и 5 IFU / мл мочи). Тем не менее, исследования показали 100% позитивность при разведениях КТ <1 IFU / тест.
IFU = учебные блоки включения
NG:

Сообщается об аналитической чувствительности 50 клеток / тест (362 клеток / буфер и 250 клеток / мл мочи)
Тем не менее, исследования показали 100% позитивность при разведениях GC <50 клеток / тест6.
Справочные значения и отчетность о результатах
РРНК Chlamydia trachomatis (CT) не обнаруживается.
Neisseria gonorrhoeae (NG) не обнаруживаемая рРНК.

Результаты представлены как необнаружимые / положительные / двусмысленные. В случае двусмысленного результата, тест проводится повторно; если получен сомнительный результат, рекомендуется повторить сбор образцов.

Можно получить неверный результат, который указывает на ошибку в аналитическом процессе, которая необходима для повторного тестирования образца или, в некоторых случаях, для повторного сбора урожая.

Интерпретация результатов, ограничений и вмешательств

Неопределяемый результат указывает на то, что CT и / или G рРНК не присутствует в тестируемом образце; однако наличие инфекции не исключается, поскольку частота выявления зависит от сбора образца, количества рибосомальной РНК в образце, отсутствия ингибиторов или стадии инфекции.

Положительный результат указывает на то, что рРНК для КТ и / или ГХ присутствует в тестируемом образце и является сильным показателем инфекции.
Однако положительная прогностическая ценность теста зависит от распространенности инфекции в определенной популяции или группе. Таким образом, в группах с высокой распространенностью венерических заболеваний положительная прогностическая ценность возрастает. Напротив, в группах с низкой распространенностью этих категорий инфекций положительные результаты следует тщательно интерпретировать в общем клиническом контексте пациента, принимая во внимание возможность повторного тестирования другими методами (например, культура для Neisseria gonorrheae).

Присутствие слизи в эндоцервикальных образцах не влияет на обнаружение CT и GC в тесте APTIMA Combo 2, но рекомендуется удалить избыток слизи, чтобы в образце было достаточное количество CT-инфицированных эндоцервикальных клеток. Кроме того, наличие крови не влияет на эффективность теста, если только он не обнаружен в процентах, превышающих 10% (об. / Об.) В образцах эндоцервикала и более 30% (об. / Об.) В образцах мочи.

Никакого вмешательства со смазками или спермицидами не наблюдалось для эндоцервикальных тампонов. Кроме того, образцы мочи не влияли на присутствие витаминов и минералов.

Производительность, установленная для образцов мочи, основана на тестировании первого потока мочи. Для других типов образцов мочи эффективность не оценивалась.
Тест также обнаруживает не содержащие плазмиды варианты C. trachomatis.

Никаких перекрестных реакций с непатогенными видами Neisseria, присутствующими в ротоглотке, для GC обнаружено не было.

В целом, тест не рекомендуется для оценки эффективности лечения антибиотиками, поскольку нуклеиновые кислоты в этих возбудителях могут сохраняться в течение не менее 3 недель после окончания терапии. По истечении этого периода повторное тестирование полезно для беременных женщин, когда подозревается несоблюдение режима лечения или повторное заражение и в тех случаях, когда симптомы сохраняются.

Список используемой литературы
1. Центры по контролю и профилактике заболеваний. 2011. Эпиднадзор за болезнями, передаваемыми половым путем. 2010. Атланта, Джорджия: США. Департамент здравоохранения и социальных служб.
2. Бетти А. Форбс, Даниэль С. Сам, Алиса С. Вайсфельд - Обязательные внутриклеточные и некультурабильные бактериальные агенты. Диагностическая микробиология Бейли и Скотта, 12 изд., 2007, 510-524.
3. Ричард А. МакПетерсен, Мэтью Р. Пинкус. Хламидийные, риккетсиозные и микоплазменные инфекции. В Генри Клиническая диагностика и управление лабораторными методами - Sauders Elsevier 21-Ed 2007 - стр. 1002, 1003.
4. Центры по контролю и профилактике заболеваний, «Рекомендации по лечению венерических заболеваний 2010», MMWR Recomm Rep, 2010, том 59 (RR12): 1-116.
5. Бернард М. Карнатх. Проявления гонореи и хламидийных инфекций. В больнице врач май / июнь 2009 г. www.turner-white.com.
6. Сыневская лаборатория. Конкретные ссылки на используемую технологию работы 2014 года. Тип ссылки: Каталог.
7. Джонсон Р.Э., Ньюхолл В.Дж., Папп Дж.Р. и др. «Скрининговые тесты для выявления Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae», MMWR Recomm Rep, 2002, 51 (RR15): 1-38.
8. Специализированные лаборатории. Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae для пациентов с симптомами и без симптомов. www.specialtylabs.com. Тип ссылки: Интернет-связь.
9. Б. Бояджян, Т. Яшина, Дж. Х. Ятабэ, М. Патнаик, С. С. Хилл. Сравнение анализов APTIMA CT и GC с анализом APTIMA Combo 2, анализом Abbott LCx и прямым анализом флуоресцентных антител и культур для выявления Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae. В журнале клинической микробиологии, июль 2004 г., том 42, № 7, 3089–93.
10. Crotchfelt, К. A., B. Pare, C. Gaydos, T. C. Quinn. Обнаружение Chlamydia trachomatis с помощью Gen-Probe AMPLIFIED Chlamydia Trachomatis (AMP CT) в образцах мочи от мужчин и женщин и эндоцервикальных образцах от женщин. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 391-394.
11. Мёллер Дж. К., Педерсен Л. Н., Перссон К. Сравнение транскрипционно-опосредованной амплификации Gen-Probe, ПЦР Abbott и ПЦР Roche для выявления штаммов дикого типа и мутантных плазмид Chlamydia trachomatis в Швеции. J Clin Microbiol. Декабрь 2008 г .; 46 (12): 3892–3895.
12. Клиника Майо, Медицинские лаборатории Майо. Справочные лабораторные службы для организаций здравоохранения. Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae путем амплификации нуклеиновых кислот (GEN-PROBE). www.mayomedicallaboratories.com. 2014. Тип ссылки: Интернет-связь.