Цитохимическое определение неспецифической эстеразы

Цитохимия основана на микроскопическом исследовании клеточных химических компонентов: нуклеопротеинов, белков, гидратов углерода, липидов и ферментов.

Цитохимические окраски предоставляют информацию о клеточной линии и дифференцировке кроветворных клеток и играют важную роль в оценке гематологических аномалий, особенно в дифференциальной диагностике и классификации злокачественных заболеваний крови.

Один из принципов, который следует учитывать, заключается в том, что положительная реакция всегда ценна, в то время как отрицательная реакция неубедительна. Для уверенности в большинстве случаев цитохимические реакции практикуются с положительным свидетелем реакции 1;2.

-отрицательный ; +/- слабо положительный ; + положительный ;+ +интенсивно положительный

Правильный лабораторный диагноз LAM с подтипами FAB и LAL требует подтверждения данных оптической микроскопии – морфологии и цитохимической окраски – с иммунофенотипированием, возможно, данными электронной микроскопии.

Эстеразы-это ферменты, которые гидролизуют альфатические и ароматические сложные эфиры и полезны для отличия клеток гранулоцитарного ряда от клеток моноцитарного ряда.

Naphthol AS-D хлорацетатэстераза присутствует в клетках гранулоцитарной линии и обнаруживается в небольшом количестве или отсутствует в моноцитах и предшественниках моноцитов.

Неспецифическая эстераза, как следует из названия, является убиквитарным ферментом, присутствующим в нескольких типах клеток, включая моноциты, Т-клетки и мегакариоциты. Может использоваться в качестве субстратов: Альфа-нафтилацетат, Альфа-нафтил бутират, нафтол AS-D ацетат4.

Принцип метода

Мы будем ссылаться на реакцию Альфа-нафтилацетатэстеразы( ANAE): Альфа-нафтилацетат гидролизуется эстеразами до Альфа-нафтола, который в присутствии соли диазония образует красно-коричневое соединение, нерастворимое в воде1;3.

Рекомендации по определению неспецифических эстераз

- диагностика при моноцитарных типах М4 и М51.

Подготовка пациента-натощак или после приема пищи3.

Собранный образец

а) капиллярная и/или медуллярная аспирационная кровь-мазки

б) рекомендуется одновременный сбор венозной крови для гемограммы 3.

Причины отклонения образца

- нефиксированные мазки в течение максимум 8 часов после сбора урожая;

- мазки из крови, собранной на EDTA3.

Контейнер для сбора образца

а) мазки капиллярной крови выполняются непосредственно на предметных стеклах микроскопии;

б) vacutainer с EDTA K3 (фиолетовая крышка), для гемограммы 3.

Собранное количество

а) 3-5 мазков;

Б) 2 мл3.

Необходимая обработка после сбора образца

Желательно, чтобы фиксация мазков производилась в течение первых 30 минут после сбора образцов. Возможно, это можно сделать в течение первых 8 часов. Фиксирующая смесь: этиловый спирт 9 частей + формол 40% 1 часть. Фиксация рассчитана на 30 секунд, после чего мазки смываются струей водопроводной воды. Фиксированные мазки могут сразу окрашиваться или храниться в течение нескольких дней при комнатной температуре, вплоть до окрашивания3.

Стабильность образца

- нефиксированные мазки стабильны максимум 8 часов при 18-30ºC;

- фиксированные мазки стабильны в течение 5 дней при температуре камеры3.

Метод-микроскопическое исследование3.

Интерпретация результатов

В моноцитах ферментативная активность ANAE выделяется появлением красно-коричневого соединения с диффузным, умеренным или интенсивно окрашенным видом (M – моноцитарный тип). В Т-клетках (включая Т-лимфобласты) и мегакариобластах внешний вид более очаговый, в области Гольджи или парануклеарной. Аспект окрашивания в определенной степени полезен для дифференциации типов клеток.

Стадия ингибирования NaF была добавлена, чтобы сделать неспецифическую эстеразу „более специфичной”. Активность фермента в клетках моноцитарной линии ингибируется NaF, тогда как в остальных клетках активность сохраняется.

Альфа - нафтилацетатэстераза обычно отрицательна в клетках гранулоцитарного ряда. Бластные клетки в LAM-M0, M1 и M2 обычно отрицательны. В Lam-M3 неспецифическая эстераза положительна в 20-30% случаев, будучи слабее по интенсивности, чем в моноцитах; реакция чувствительна к ингибированию NaF примерно в 1/3-1/2 положительных случаев.

Моноцитарные бластные клетки в LAM-M4 имеют интенсивно положительную диффузную активность ANAE (тип M) более 20%, а в Lam-M5-более 80%, чувствительную к NaF.
Мегакариобласты лейкемии в LAM-M7 имеют отчетливую очаговую позитивность, частично ингибируемую NaF. Эритробласты в LAM-M6 обычно обладают положительной, не подавленной NaF активностью ANAE.

Бластные клетки в LAL являются отрицательными; очень редко могут возникать слабозависимые гранулярно выглядящие клетки ANAE с различной чувствительностью к NaF1;4.

 Библиография