Ген BCR-ABL (количественное обнаружение)

Общая информация

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) – прототип лейкозных состояний – представляет собой клональное заболевание стволовых клеток костного мозга, которое преимущественно приводит к гиперпролиферации гранулоцитарных элементов на всех стадиях созревания.

ХМЛ характеризуется наличием транслокации t-хромосомы (9;22) (q34; q11), которая первоначально рассматривалась как аномалия 22 q - (хромосома 22 с укороченной длинной рукой) и называлась Филадельфийской хромосомой (Ph) (Nowell, 1960; Rowley, 1973). Эта транслокация приводит к сопоставлению гена тирозинкиназы ABL1 (Abelson) на хромосоме 9 посредством гена BCR (Breakpoint Cluster Region) на хромосоме 22 с образованием слитого гена BCR-ABL1 (слияние головы и хвоста 5’ BCR-capat 3’ ABL; см. Рисунок 1). Аномальный ген транскрибируется в гибридную мРНК, которая в конечном итоге вызывает синтез химерного белка Bcr-Abl с вегетативной тирозинкиназной активностью 3;8.

Рисунок 1: нормальные хромосомы 9 и 22-транслокация – 9,22)

 

Цитогенетически идентичная транслокация при ХМЛ может быть обнаружена примерно у 20-25% взрослых пациентов и у ~5% детей с острым лимфобластным лейкозом (LAL), а также в некоторых редких случаях острого миелобластного лейкоза (LAM)4;8.

Исследования того, как нормальные гены BCR и ABL регулируют рост, показали некоторые возможности, с помощью которых молекула himerica может способствовать неконтролируемой пролиферации клеток 8.

У нормальных людей белки, кодируемые генами BCR и ABL, виртуально экспрессируются во всех клетках 3.

Ген ABL1

1. представляет собой протоонкоген, кодирующий тирозинкиназу Abl1 с молекулярной массой 145 кд, которая фосфорилирует свои собственные остатки тирозина (аутофосфорилирование) и остатки других белков. Продукт транскрипции имеет либо 6, либо 7 КБ, в зависимости от режима альтернативного сплайсинга. Когда N-концевой конец белка кодируется экзоном 1 (ABL1A), белок локализуется в ядре; когда участвует Экзон 1B (ABL1B), конформация N –концевого глицина изменяется миристиновой кислотой, что приводит к нацеливанию белка на плазматическую мембрану
2. Abl представляет собой сложную белковую структуру, по крайней мере, с тремя функциональными доменами: доменом, ответственным за фосфорилирование, и двумя другими, SH2 и SH3, который регулирует активность первого. Способность Abl к трансформации клеток пропорциональна его способности фосфорилировать остатки тирозина. Предполагается, что Abl связывается с протеин-мишенью; домен SH2 увеличивает киназную активность, способствуя клеточной трансформации, в то время как домен SH3 снижает активность Abl. Кроме того, считается, что SH3 также будет вмешиваться в регуляцию активности GTP-azice, которая, как известно, участвует в пути передачи сигнала другого протоонкогена, ras, чья аномальная экспрессия связана с развитием рака.

Также описаны два других функциональных домена на уровне белка Abl: домен, который связывается со специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК, что предполагает возможность того, что Abl также может быть фактором транскрипции; во-вторых, есть область, которая облегчает связывание F-актина в цитоплазме. В ходе исследований было показано, что потеря нормальной N-концевой области Abl, которая опосредует саморегуляцию в результате транслокации Ph, приводит к увеличению активности фосфорилирования тирозина, а также к усилению связывания F-актина, тем самым превращая Abl в онкогенный белок, который может быть ответственен за аномальную пролиферацию миелоидных предшественников в LMC8;13.

Ген BCR имеет длину 130 КБ и содержит 23 экзона. Первоначально считалось, что первый Интрон, разделяющий экзоны 1 и 2, имеет длину 68 КБ, но теперь известно, что он включает два дополнительных экзона (альтернативный Экзон e1’ и альтернативный Экзон e2’). Два продукта транскрипции 4, 5 и 7, 0 КБ соответственно были идентифицированы в зависимости от альтернативного режима сплайсинга; таким образом, могут быть получены 2 белка разного размера, 130 и 160 кда6 соответственно. Белок Bcr экспрессируется на первичных стадиях миелоидной дифференцировки, уровень или снижение в зрелых клетках; по мнению некоторых исследователей, он может представлять собой Серин/треонинкиназу, а не тирозинкиназу в качестве белка ABL8.

Нетранслированная 5’ - область гена имеет большое значение, потому что слитый ген, возникающий в результате транслокации Ph, регулируется промотором BCR. Богатая нуклеотидными основаниями G и C, эта область способствует образованию петлевых и стволовых структур с возможной ролью в трансляционной регуляции, распространенной во многих генах "housekeeping" (гены, постоянно экспрессируемые во всех клетках)5;12. Ген убиквитарно экспрессируется с высоким уровнем информационной РНК в кроветворной ткани и мозге. Первый Экзон имеет большое значение, будучи включенным во все продукты слияния BCR-ABL. На его уровне выражена активность Серин / треонинкиназы белка Bcr; таким образом, Bcr может аутофосфорилировать остатки серина и треонина. При положительных состояниях Ph фосфотирозины присутствуют как в белках Bcr, так и в Bcr-Abl из-за активности тирозинкиназы Bcr-Abl.

Первый Экзон компонента Bcr в Bcr-Abl также фосфорилируется до остатков серина и треонина. Кроме того, он содержит несколько доменов, которые связывают области SH2 других белков и в этом отношении играют важную роль в сборке комплексов передачи сигнала. Одним из таких доменов SH2, связывающихся с Bcr, является домен белка Abl, и это взаимодействие опосредуется фосфорилированным серином и треонином. Последовательности Bcr, участвующие в этом взаимодействии, расположены между аминокислотами 192-242 и 298-413 и играют важную роль в онкогенной активации Bcr-Abl. Другим функциональным доменом в экзоне 1 Bcr является олигомеризация, в результате которой было обнаружено, что Bcr и Bcr-Abl являются ко-иммунопреципитированными. Домен олигомеризации также влияет на локализацию белка Bcr-Abl4; 13. Хотя нормальный белок Abl можно идентифицировать как в ядре, так и в цитоплазме, было обнаружено, что Bcr-Abl локализуется только в цитоплазме и частично связан с цитоскелетом. Делеция домена олигомеризации Bcr сопровождается уменьшением связывания Bcr-Abl с F-актином, демонстрируя, что этот домен усиливает способность связывания F-актина с помощью Bcr-Abl и, по крайней мере, частично отвечает за цитоплазматическую локализацию oncoproteinei15.

На уровне ДНК слияние BCR-ABL1 характеризуется гетерогенностью точек разрыва (”точки разрыва") и вариацией продуктов транскрипции, полученных с помощью альтернативного сплайсинга. Таким образом, точки разрыва гена BCR на хромосоме 22 находятся в трех разных областях: majora (M-bcr), minora (m-bcr) и μ-bcr; область M-bcr относительно короткая (5, 8 т. п. н.), включает 5 экзонов, называемых b1-b5 (на самом деле это экзоны E12-e16 гена BCR), а точки разрыва расположены специфически между экзонами b2 и b3 или b3 и b4; m-bcr включает экзоны e1, E2, E1’ и E2’;   μ-bcr включает экзоны e19 и e20. С другой стороны, точки разрыва гена ABL распределены по длине 300 КБ между 5’ - концом и экзоном 2. В зависимости от местоположения точек разрыва сегменты различных размеров гена BCR сливаются с 3 ' - последовательностями гена ABL; эти слитые гены будут генерировать 4 продукта транскрипции – молекулы мРНК e1a2, b2a2, b3a2 и e19a2-которые в конечном итоге приведут к синтезу 3 химерных белков с различной молекулярной массой (p190, p210 и p230 соответственно) и, возможно, с различными функциями (см. Рисунок 2).

Рис.2 точки разрыва генов BCR и ABL (отмечены стрелками) и полученные продукты транскрипции

(Адаптация Chasseriau JMD, ноябрь 2004, vol.6, номер.4)

Luand in considerare aceste date, se pot distinge cel putin 3 entitati clinico-patologice in LMC: p210 LMC, p190 LMC si p230 LMC. Marea majoritate a cazurilor de LMC este asociata cu produsii de transcriptie b2a2 si b3a2 care conduc la sinteza proteinei p210; desi in cele mai multe cazuri este prezent un singur tip de transcript, ocazional tumorile pot prezenta un splicing alternativ si produce simultan ambii produsi de transcriptie. Proteina himerica p190 este detectata in ~50% din cazurile de LAL Ph pozitive, precum si in cazuri rare de LMC si LAM.  Proteina himerica de greutate mai mare (p230) este prezenta  in forme rare de LMC caracterizate printr-o componenta neutrofilica proeminenta; aceste cazuri nu trebuie incluse insa in entitatea „leucemie neutrofilica cronica”, ci mai degraba considerate ca fiind LMC, datorita prezentei genei de fuziune BCR-ABL. Restul cazurilor de LAL Ph pozitive demonstreaza prezenta produsilor de transcriptie b3a2 sau b2a2. Merita sa fie mentionat faptul ca au fost identificate puncte de ruptura ale genei BCR in afara regiunilor mentionate in unele cazuri rare de LMC si LAL. In plus translocatia (9,22) a fost foarte rar detectata la pacienti cu alte neoplazii hematologice, cum ar fi mielomul multiplu si limfoamele cu celule B^3;8;10.

Semnificatia clinica a diferitelor puncte de ruptura in LMC nu este clar definita. Cu toate acestea s-au putut efectua anumite corelatii. LMC survenita atat la copil cat si la adult este asociata aproape intotdeauna cu proteina himerica p210; in timp ce doua treimi din adulti prezinta transcriptul b3a2, la copii predomina b2a2. Mai mult, doua grupuri diferite de cercetatori au raportat asocierea b3a2 cu un numar mai mare de trombocite decat b2a2. Aceasta constatare nu a fost confirmata insa de un al treilea grup din Marea Britanie⁸. In cazurile de LMC asociate cu transcriptul e1a2 componenta monocitara este mai proeminenta, iar numarul total de leucocite, bazofilia si splenomegalia sunt mai reduse decat in p210 LMC¹⁰.

Gene de fuziune BCR-ABL pot fi detectate si in leucocitele unor persoane sanatoase; in timp ce BCR-ABL se exprima relativ frecvent in celulele hematopoietice, doar foarte rar celulele dobandesc modificarile necesare pentru a produce leucemie^3;10.

Activitatea tirozin kinazica este esentiala pentru procesele de semnalizare celulara si de crestere, iar intensificarea acesteia a fost asociata cu modificari oncogenice in cateva sisteme. Atat p210^Bcr-Abl cat si p190^Bcr-Abl prezinta activitate tirozin-kinazica constitutiva (constanta indiferent de cerintele fiziologice), cu niveluri mai mari inregistrate la proteina p190^Bcr-Abl. Majoritatea tirozinelor autofosforilate se gasesc la nivelul segmentului Bcr din Bcr-Abl, iar activitatea tirozin kinazica este atribuita domeniului kinazic localizat in segmentul Abl. Se crede ca gradul activitatii de transformare a Bcr-Abl se coreleaza cu gradul activitatii tirozin-kinazei si ca aceasta activitate a fost implicata in autonomia fata de factorii de crestere pe care Bcr-Abl o confera celulelor. De asemenea Bcr-Abl induce fosforilarea multor proteine implicate in transductia semnalului, adeziunea celulara, proliferare si apoptoza⁴.

Clasic, sunt descrise 2 sau 3 stadii clinice de evolutie a bolii, insa in practica medicala curenta a devenit din ce in ce mai frecvent ca pacientii sa fie diagnosticati in stadiul preclinic ca urmare a cresterii numarului controalelor periodice. Studiile au aratat ca exista o perioada de aproximativ 6 ani din momentul aparitiei translocatiei cromozomiale si dezvoltarea manifestarilor clinice. Primul stadiu clinic este reprezentat de o faza cronica care in trecut avea o durata medie de 4 ani, urmata de o faza mai agresiva – faza accelerata/faza blastica cu un prognostic rezervat. Faza accelerata se caracterizeaza prin cresterea numarului de blasti in sangele periferic si/sau maduva osoasa, bazofilie, trombocitopenie persistenta, cresterea dimensiunilor splinei si a numarului de leucocite in conditiile tratamentului adecvat, evidentierea unei evolutii clonale la examenul citogenetic. Faza blastica include urmatoarele elemente: ≥20% blasti in sangele periferic si/sau maduva osoasa, proliferarea extramedulara a blastilor sau prezenta unor aglomerari mari de blasti in maduva osoasa. Aceasta faza denota transformarea LMC in leucemie acuta, care poate fi de linie mieloida (~70%) sau limfoida (~30%).

Diagnosticul CML se bazeaza pe examenul frotiului de sange periferic, biopsia de maduva osoasa, examenul citogenetic pentru detectarea cromozomului Philadelphia si testele moleculare pentru evidentierea genei de fuziune BCR-ABL1 sau a produsilor de transcriptie asociati acesteia⁸.

Tratamentul definitiv al pacientilor cu LMC este transplantul de maduva osoasa alogenic sau transplantul de celule stem. Cu toate acestea, dezvoltarea inhibitorilor de tirozin kinaza cu introducerea pe scara larga a preparatului imatinib mesylate  (Gleevec) a modificat semnificativ tratamentul de prima linie al LMC si a demonstrat succesul terapiei cu tinta moleculara³. Imatinibul, un inhibitor de tirozin kinaza specific pentru Abl,  inhiba proliferarea liniilor celulare din LMC prin suprimarea activitatii kinazice a Bcr-Abl⁸.

Detectia prin RT-PCR a produsilor de transcriptie ARNm hibrizi BCR-ABL1 prezinta valoare in diagnosticul LMC si LAL Ph pozitive. Desi 98% dintre pacientii cu LMC sunt BCR-ABL pozitivi, intr-un numar redus de cazuri cu morfologie sugestiva pentru LMC marker-ul genetic lipseste. Aceste cazuri incadrate ca LMC atipica, leucemie mielo-monocitara cronica sau ca alte neoplazii mieloproliferative sau sindroame mielodisplazice beneficiaza de alte optiuni terapeutice decat cele de LMC Ph pozitive. Pe de alta parte, sunt posibile manifestari atipice in LMC, iar in aceste cazuri demonstrarea anomaliei BCR-ABL este critica pentru diagnosticul corect si terapia adecvata. De asemenea testele moleculare au valoare diagnostica in situatiile in care examenul citogenetic este negativ pentru cromozomul Philadelphia (~5% din cazuri) ca urmare a unei anomalii BCR-ABL criptice sau submicroscopice. Detectia marker-ului  la adultii si copiii cu LAL identifica acea categorie de pacienti care prezinta un risc crescut de esec terapeutic si care ar putea beneficia de programe de tratament intensiv^3;8.

Un alt rol al testelor moleculare este monitorizarea raspunsului terapeutic la pacientii cu LMC. Astfel, dupa obtinerea remisiunii citogenetice sub Imatinib testele PCR cantitative reprezinta metoda de electie  pentru detectarea bolii minime reziduale (MRD)⁸. De asemenea acestea isi gasesc aplicatia si la pacientii care au primit transplant medular pentru identificarea precoce a recurentelor bolii¹⁰.

Administrarea de Imatinib reprezinta tratamentul standard al pacientilor cu LMC, iar ELN (European LeukemiaNet) si NCCN (National Comprehensive Cancer Network) recomanda o doza zilnica de 400 mg ca optiune terapeutica de prima linie. Pacientii care obtin un raspuns citogenetic complet necesita monitorizarea raspunsului molecular la 3-6 luni pentru identificarea cazurilor de raspuns suboptimal si imbunatatirea tratamentului prin administrarea unor doze mai mari de Imatinib sau a unor terapii alternative. De asemenea monitorizarea prin teste moleculare permite recunoasterea precoce a rezistentei primare sau dobandite la  Imatinib. Inhibitorii de tirozin kinaza de generatia a doua, cum ar fi nilotinib si nisatinib, actioneaza mai eficient asupra tintei moleculare BCR-ABL fiind asociate cu o rata mai mare de raspuns citogenetic si molecular precoce; cuantificarea BCR-ABL ARNm va avea astfel o importanta si mai mare in viitorul apropiat.

Raspunsul molecular major (MMR) este definit prin scaderea nivelului BCR-ABL cu cel putin 3 log (de 1000 ori) fata de o valoare bazala standardizata (standardized baseline). Aceasta valoare a fost stabilita prin procesarea in 3 laboratoare centrale implicate in studiul IRIS (International Randomized Study of Interferon versus STI571) a unor esantioane efectuate din 30 probe provenite de la pacienti cu LMC inainte de initierea terapiei¹¹. Fiecare laborator a obtinut o valoare mediana pentru nivelul produsilor de transcriptie in cele 30 probe analizate care a constituit valoarea bazala standardizata specifica laboratorului. Reducerea cu > 3 log a nivelului BCR-ABL din aceasta valoare bazala standardizata specifica a definit raspunsul molecular major. Faptul ca s-a utilizat o valoare bazala absoluta (comuna tuturor participantilor) in loc de una relativa (individualizata) a asigurat faptul ca pacientii cu raspuns similar prezinta acelasi grad de boala reziduala.  Obtinerea unui MMR este asociata cu o probabilitate mai mare de raspuns pe termen lung si cu imbunatatirea perioadei de supravietuire fara progresia bolii (PFS = progression-free survival) la pacientii tratati cu Imatinib. Astfel, in studiul IRIS toti pacientii cu MMR la 12 luni de la inceputul tratamentului nu au prezentat nici un semn de faza accelerata sau criza blastica la evaluarea efectuata la 60 luni. Este important de mentionat faptul ca in acest  studiu a fost evitata folosirea termenului de „raspuns molecular complet“ fiind determinat numai numarul pacientilor la care s-a obtinut un rezultat nedetectabil al produsilor de transcriptie cu o sensibilitate analitica de 4.5 log sub valoarea bazala standardizata. Deoarece un rezultat nedetectabil reflecta limita de detectie a metodelor actuale, acesta nu trebuie considerat o dovada de eradicare a bolii¹⁶.

Учитывая клиническую важность оценки наличия остаточного минимального заболевания, были предприняты дополнительные усилия по стандартизации количественной оценки BCR-ABL. В связи с этим группа экспертов предложила на международном консенсусном совещании Bethesda (2005), чтобы измерения BCR-ABL были выражены по международной шкале (IS), в которой используются два стандартных значения: стандартизированное базальное значение (установленное в исследовании IRIS), которое считается 100% на IS, и стандартизированное значение MMR, которое считается 0.1% на IS (соответствует 3-логарифмическому сокращению по сравнению с базовым значением). Значение 1-2% IS в целом соответствует пределу обнаружения Ph1-положительных метафаз при стандартном цитогенетическом исследовании. Значение < 0.1% IS указывает на основной молекулярный ответ (MMR)11.

Рекомендации по проведению теста

• положительный диагноз ХМЛ и LAL Ph;
• мониторинг молекулярной реакции на лечение и определение прогноза;
• обнаружение минимального остаточного заболевания8.

Собранный образец-а) венозная кровь; б) медуллярная аспирация9.

Контейнер для сбора-а) и Б) вакуум, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта9.

Собранное количество-а) 3-5 мл; Б)3 мл (минимум 1 мл) 9.

Причины отторжения образца-использование гепарина в качестве антикоагулянта9.

Стабильность образца-максимум 3 дня при 2-8ºC9.

Метод

Используются два типа тестировщиков:

Качественное обнаружение продуктов транскрипции мРНК BCR-ABL1 (для диагностических целей)

Включает следующие этапы:

- выделение и очистка РНК;

- обратная реакция транскрипции (от-ПЦР) для получения комплементарной ДНК (Кднк), используемой в качестве матрицы для амплификации ПЦР;

- мультиплексная ПЦР (обнаружение одной или нескольких целевых последовательностей ДНК в смеси с использованием одного или нескольких наборов олигонуклеотидных праймеров) + две нестед-ПЦР, оптимизированные для обнаружения различных точек разрыва в генах BCR и ABL;

-каждый прогон образцов сопровождается контрольной реакцией с Кднк из клеточной линии с т-транслокацией (9;22) и отрицательной контрольной реакцией с Кднк клеточной линии, которая не показывает транслокацию; для контроля качества РНК в образце и эффективности реакции обратной транскрипции параллельно используется амплификация от-ПЦР фрагмента Кднк гена ABL человека;

- обнаружение продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле;

- предел обнаружения теста составляет не менее 1 клетки ХМЛ на 100 000 нормальных клеток 1;7;9.

Количественное обнаружение продуктов транскрипции мРНК BCR-ABL1 (для целей мониторинга)

Будет определена экспрессия продуктов слияния (№10). копии BCR-ABL) связаны с экспрессией гена внутреннего контроля (ABL) с помощью количественной ПЦР в реальном времени LightCycler с окончательным преобразованием в процентах.

Качественное обнаружение

Отрицательный результат указывает на отсутствие транскрипта (мРНК) BCR-ABL.

Положительный результат указывает на наличие продукта транскрипции BCR-ABL, тип которого будет сообщен9.

Количественное обнаружение

Результат будет выражен в процентах от общего ABL BCR-ABL, например:

[Нет. дети BCR-ABL / нет. ABL дети] x 100

Уровень продуктов транскрипции BCR-ABL отражает количество остаточных лейкозных клеток.

Прогрессирующее снижение уровня продуктов транскрипции в ходе лечения Иматинибом представляет собой текущий критерий молекулярного ответа при хроническом миелоидном лейкозе.

MMR будет сообщено в соответствии с исследованием IRIS.

5-10-кратное увеличение уровня продуктов транскрипции (0, 5 или 1 log) было предложено в качестве порогового значения для молекулярного восстановления или устойчивости к обработке 9;16.