ВПЧ (Папиллома) выявление видов высокого риска + расширенное генотипирование

Общая информация и рекомендации

Согласно текущим данным, стойкая инфекция генотипами ВПЧ высокого риска (онкогены, hrHPV) является необходимым условием для развития рака шейки матки и его предшественников. В основном, наличие онкогенных типов ВПЧ было продемонстрировано почти во всех случаях рака шейки матки.

Генотип ВПЧ 16 считается наиболее канцерогенным, на него приходится около 55-60% всех видов рака шейки матки. За ним следует генотип ВПЧ 18, участвующий в 10-15% случаев, чаще при железистых раковых заболеваниях, аденокарциномах и аденоскуамозных карциномах, чем при плоскоклеточных карциномах. Около 10 других генотипов ВПЧ вызывают оставшиеся 25-35% случаев рака шейки матки.1.

В 2012 году Международное агентство по исследованию рака (IARC) пришло к выводу, что имеются достаточные доказательства участия в канцерогенезе шейки матки 12 типов ВПЧ высокого риска (HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 и HPV59), которые считаются канцерогенными 1а, для HPV68 существуют меньше доказательств, поэтому он считался канцерогенным 2a (вероятно, канцерогенным). Кроме того, 7 других филогенетически родственных типов ВПЧ (HPV26, HPV53, HPV66, HPV67, HPV70, HPV73 и HPV82) были идентифицированы при уникальных инфекциях ВПЧ в некоторых редких случаях рака шейки матки, что, таким образом, считается возможным канцерогенным (канцерогенным 2b). В недавнем исследовании показано, что 8 вероятных/, возможно, канцерогенных типов ВПЧ (группы 2A и 2b) биологически активны при отдельных инфекциях и влияют на те же клеточные пути, что и типы ВПЧ, которые считаются полностью канцерогенными (группа 1A). Исследователи также обнаружили, что добавление в группу из 13 типов ВПЧ высокого риска (канцерогены 1 и 2а) 7 возможных канцерогенных типов ВПЧ увеличило на 2.6% процент ВПЧ-положительных раковых заболеваний шейки матки. По этой причине будет введена новая классификация канцерогенных типов ВПЧ. Однако, учитывая тот факт, что они очень редко участвуют в раке шейки матки, нет необходимости включать генотипы ВПЧ категории 2B в скрининговые тесты или вакцины 2;3.

Установление причинно-следственной связи между ВПЧ и раком шейки матки наряду с пониманием эпидемиологии и естественного развития инфекции ВПЧ привело к новой модели канцерогенеза шейки матки: приобретение ВПЧ, персистенция ВПЧ (vs clearance), прогрессирование до предраковых поражений и инвазия. Большинство ВПЧ-инфекций временно устраняются иммунной системой хозяина в течение 1-2 лет. Постоянные инфекции связаны с повышенным риском предраковых поражений. Таким образом, персистенция в течение 1 года или 2 лет, особенно HPV16, представляет 20-30% риск развития CIN3 или более поздних поражений (CIN3+); необработанный CIN3 имеет 30% вероятность привести к инвазивному раку шейки матки в течение 30 лет, в то время как только 1% обработанных CIN3 станут инвазивными 1.

Основная цель скрининга рака шейки матки-предотвратить заболеваемость и смертность от этого вида рака. Оптимальной стратегией скрининга является выявление поражений-предшественников, способных прогрессировать до инвазивного рака, и в то же время избегать выявления преходящих инфекций ВПЧ. Цитологическое исследование Бабеш-Папаниколау значительно снизило заболеваемость раком шейки матки в странах, которые приняли эффективные программы скрининга. Однако были описаны важные ограничения цитологии, в том числе снижение чувствительности (50-60%), а также низкая специфичность, что приводит к необходимости повторения скрининга через короткие промежутки1;4.

Введение в клинику тестирования на ВПЧ было направлено на улучшение частоты выявления предраковых поражений и рака шейки матки. Для надлежащего скрининга необходимо только тестирование групп ВПЧ высокого риска, а не генотипов ВПЧ низкого риска.1.

Первоначально тестирование hrHPV использовалось для сортировки двусмысленных цитологий (ASC-US), в дальнейшем было введено в США цитирование цитологии Pap + HRHPV ДНК у женщин ≥ 30 лет, и в течение последних лет несколько исследований показали потенциал тестов hrHPV для использования при первичном скрининге рака шейки матки из-за повышенной чувствительности при обнаружении высокоуровневых интраэпителиальных плоскоклеточных поражений и очень хорошей отрицательной прогностической ценности. Однако в исследовании Horizon были обнаружены значительные различия между результатами, полученными с помощью различных hrHPV при первичном скрининге рака шейки матки у женщин старше 30 лет. 5.

есты на ВПЧ можно разделить на 2 категории:

• тесты с повышенной чувствительностью и аналитической специфичностью: выявляет все инфекции, вызванные hrHPV (как переходные, так и клинически значимые);
• тесты с повышенной клинической чувствительностью и специфичностью: выявляют только клинически значимые инфекции ВПЧ.

На практике выбор тестов на ВПЧ будет проводиться в соответствии с преследуемой целью:

• тесты с повышенной чувствительностью и аналитической специфичностью полезны в эпидемиологических исследованиях, для установления эффективности вакцин и мониторинга распространенности ВПЧ
• тесты с повышенной клинической чувствительностью и специфичностью полезны при скрининге рака шейки матки, сортировке двусмысленной цитологии, мониторинге после вмешательства для CIN2+.

Таким образом, для надлежащего скрининга рака шейки матки важно использовать тесты на ВПЧ, которые выявляют клинически значимые инфекции и игнорируют преходящие инфекции (связанные с низким уровнем вирусной нагрузки).

Международный консорциум установил требования, которым должен соответствовать тест на ВПЧ, чтобы быть полезным при скрининге рака шейки матки:

Подготовка пациентов - во время менструального цикла не следует собирать образец. Кроме того, за 48 часов до взятия образца пациенты должны избегать:

• половых отношений;
• вагинального душа;
• использование интравагинальных тампонов, местных контрацептивов, различных гелей, кремов и вагинальных процедур10.

Собранный образец-клетки экзоцервикальной, эндоцервикальной и переходной зоны между ними (зона трансформации). Зона трансформации представляет собой наиболее частую резиденцию пренеопластических поражений (повышенное перекрытие, воздействие микротравм, повышенная чувствительность к действию ВПЧ), где плоский эпителий экзокола продолжается с железистым типом на эндоцервикальном уровне через область плоскоклеточной метаплазии; сбор урожая проводится с помощью шейной щетки со съемной головкой (см. рис.1).1). Для сборки в жидкой среде рекомендуются пластиковые приспособления. После сбора съемная часть инструмента вставляется во флакон с жидкой средой ThinPrep (такой же, как для цитологии в жидкой среде, см. Рисунок 2) без каких-либо дальнейших маневров на поверхности, содержащей клеточный материал.

Рис. 1 Щеточка Cervex-Brush                                          Рис. 2 Флакон с жидкой средой ThinPrep.

Инструкции по забору материала - после осмотра шейки матки центральная часть кисти вставляется в эндоцервикальный канал, чтобы более короткие края соприкасались с экзоцервиксом. Обычно не рекомендуется протирать шейку матки перед сбором, но при необходимости ее можно легко промокнуть марлей. При фиксированной центральной части полностью поверните щетку по часовой стрелке пять раз. Собранный таким образом образец должен быть немедленно закреплен, чтобы избежать повреждения образца. Для этого отсоединяют конец щетки, содержащей собранный материал, и помещают в емкость с жидкой средой (см. рис.1).3)

                                                                                                  Рис. 3 Отсоединение кончика щеточки

Стабильность образца-клетки шейки матки, собранные в среде BD SurePath, стабильны не менее 2 месяцев при 2-8ºc9.

Метод ПЦР в реальном времени с использованием специфических праймеров для амплификации ДНК и флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов для обнаружения продуктов амплификации. Реагенты содержатся в 3 трубках (G1 ,G2 и G3), способных обнаруживать 15 hrHPV (6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, и 68), а также внутренний контроль, представленный фрагментом ДНК гена бета-глобина. Кроме того, при каждом запуске образцов используется положительный контроль ВПЧ и отрицательный контроль ВПЧ. Генотипы ВПЧ будут зарегистрированы в группах по 2,4 или 6 вирусов: группа 1: 16/31/33/35/52/58; Группа 2: 18/39/45/59; Группа 3: 6/11, и индивидуальное генотипирование типов ВПЧ 51/56/68.

Контрольные показатели и отчетность о результатах

Контрольные значения: ДНК ВПЧ для 15 генотипов высокого риска-не обнаруживается.

В случае результата ДНК ВПЧ для 15 генотипов с высоким положительным риском будет связан генотип или группа генотипов, для которых был получен положительный результат 10.

Наличие крови или слизи в образце не мешает тесту10.

Библиография

1. Saslow D, Solomon D, Lawson HW, Killackey M, Kulasingam SL, Cain J,et al. American Cancer Society, American Society for Colposcopy and Cervical Pathology, and American Society for Clinical Pathology screening guidelines for the prevention and early detection of cervical cancer. See comment in PubMed Commons belowAm J Clin Pathol. 2012 Apr;137(4):516-42.
2. Arbyn M, Tommasino M, Depuydt C, Dillner J. Are 20 human papillomavirus types causing cervical cancer? J Pathol. 2014 Dec;234(4):431-5.
3. Halec G, Alemany L, Lloveras B, Schmitt M, Alejo M, Bosch FX, et al. Retrospective International Survey andHPV Time Trends Study Group. Pathogenic role of the eight probably/possibly carcinogenic HPV types 26, 53, 66, 67, 68, 70, 73 and 82 in cervical cancer. J Pathol. 2014 Dec;234(4):441-51.
4. Melon S, Alvarez-Argüelles M, de Oña M. Molecular Diagnosis of Human Papillomavirus Infections. In Human Papillomavirus and Related Diseases – From Bench to Bedside A Diagnostic and Preventive Perspective. InTech 2013.
5. Rebolj M, Preisler S, Ejegod DM, Rygaard C, Lynge E, Bonde J. Disagreement between human papillomavirus assays: an unexpected challenge for the choice of an assay in primary cervical screening. PLoS One. 2014 Jan 20;9(1):e86835.
6. Meijer C. Regulation of HPV tests, Melbourne 2015. Reference Type: Internet Communication.
7. Meijer CJ, Berkhof J, Castle PE, Hesselink AT, Franco EL, Ronco G, et al. Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. See comment in PubMed Commons belowInt J Cancer. 2009 Feb 1;124(3):516-20.
8. Ejegod DM, Serrano I, Cuschieri KS, Nussbaumer WA, Vaughan LM, Ahmad AS et al, Clinical Validation of BD Onclarity^TM HPV AssaY Using a Non-Inferiority Test. J Med Microb Diagn 2013, S3: 003.
9. Wright TC Jr, Stoler MH, Agreda PM, Beitman GH, Gutierrez EC, Harris JM, et al. Clinical performance of the BD Onclarity HPV assay using an adjudicated cohort of BD SurePath liquid-based cytology specimens. Am J Clin Pathol. 2014 Jul;142(1):43-50.
10. Laborator Synevo. Referințe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog.