Микроделеции длинного плеча Y-хромосомы (AZFa, AZFb, AZFc)

Бесплодие является серьезной проблемой здоровья, которая затрагивает 10-15% пар, и примерно в половине случаев может быть выявлен мужской фактор.

Многие случаи мужского бесплодия связаны с олигозооспермией (сниженной выработкой сперматозоидов) или азооспермией (отсутствием сперматозоидов в эякуляте) (2). Такие изменения в выработке сперматозоидов могут коррелировать с гистопатологическими изменениями яичка различной степени тяжести, от полного отсутствия половых клеток («синдром Сертоли только для клеток» -SCO) до гипосперматогенеза и остановки созревания. С другой стороны, нарушение сперматогенеза может быть вызвано несколькими причинами: системными заболеваниями, крипторхизмом, эндокринологическими расстройствами, непроходимостью / отсутствием семенного вещества, инфекциями, лекарствами, облучением и т. Д. По крайней мере одна подгруппа этой большой категории людей с дефектами сперматогенеза (~ 30%) вовлечена в генетическую причину, что означает, что один или несколько генов, которые влияют на сперматогенез, утратили свою нормальную функцию(15).

Три генетические причины мужского бесплодия описываются следующим образом:

1. Хромосомные аномалии: присутствуют у 5-10% мужчин с олигозооспермией и 10-15% мужчин с азооспермией; самая известная аномалия - синдром Клайнфелтера (47, XXY);
2. Микроделеции Y-хромосомы: присутствуют у 10-18% пациентов с тяжелой олиго- или азооспермией;
3. мутации гена муковисцидоза (CFTR): они передаются аутосомно-рецессивно; Определенные мутации могут вызывать: двустороннее врожденное отсутствие семявыносящего протока (CBAVD), одностороннее отсутствие его без легочных или панкреатических проявлений (CUAVD) или обструкцию семявыносящего протока; вариант 5T является распространенной мутацией, связанной с CBAVD(9).

Микроделеции Y-хромосомы - относительно недавно обнаруженная генетическая причина бесплодия. Большинство из этих нарушений происходят de novo, и из-за фенотипа, связанного с бесплодием, обычно не передаются потомству(10).

Обнаружение микроделеций особенно важно для пациентов, которые намереваются использовать вспомогательную репродукцию при помощи ИКСИ (внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоидов), поскольку существует риск того, что эти генетические нарушения будут переданы потомству из-за физиологического механизма оплодотворения(2).

Y-хромосома, одна из двух гоносом (половых хромосом), содержит 2% всей клеточной ДНК и имеет длину ~ 60 миллионов пар оснований. Он играет особую роль в определении мужского пола с помощью гена SRY, состоящего из одного экзона, который кодирует транскрипционный фактор, называемый TDF (фактор, определяющий яички)(3). Мутации в этом гене приводят к женскому фенотипу с кариотипом 46, XY, а транслокация гена SRY на Х-хромосому индуцирует мужской фенотип с кариотипом 46, XX1.

Две половые хромосомы X и Y произошли от пары наследственных хромосом несколько сотен миллионов лет назад; В то время как Х-хромосома сохранила многие свойства аутосомы (несексуальной хромосомы), Y-хромосома потеряла большинство своих генов, значительно уменьшив ее размер.

Таким образом, текущая генетическая функция Y-хромосомы ограничена индукцией мужского развития во время эмбриональной жизни и поддержанием сперматогенеза у взрослых. На обоих концах Y-хромосомы есть короткие области, которые идентичны соответствующим областям на Х-хромосоме, что указывает на обмен генетического материала между этими областями (рекомбинация) во время мейоза; две псевдоаутосомные области были идентифицированы хромосомными полосами и названы PAR1 и PAR2 . Однако более 95% генетического материала Y-хромосомы специфично для мужского пола и не участвует в процессе рекомбинации X-Y - нерекомбинирующей области (NRY). В 2003 году Skaletsky и коллеги секвенировали эту область и, обнаружив, что на этом уровне происходит особый тип рекомбинации генов, они заменили название NRY на мужской специфический регион Y (MSY).

MSY - это мозаика гетерохроматических и эухроматических последовательностей. Гетерохроматин, считающийся генетически инертным, с высоким содержанием повторяющихся последовательностей, распределяется главным образом в дистальной части длинного плеча хромосомы Yq; он также обнаружен в центральной зоне, но также на уровне части ~ 400 кб, которая прерывает эухроматин из проксимального отдела Yq. Эухроматин, область, которая содержит большинство генов (~ 23 Мб: 8 Мб на коротком плече Yp и ~ 14,5 Мб на плече Yq), состоит из 3 классов нуклеотидных последовательностей:
● Х-транспонированная область (3,4 Мб, полученная транспозицией из прежних Х-сцепленных генов);
● Х-дегенеративная область (8,6 Мб, полученная из предковой аутосомы);
● ампликоновые последовательности (10,2 Мб), специфичные для Y, характеризующиеся парами почти идентичных последовательностей (сходство 99,9%), организованные в массивные палиндромы (последовательности, которые считываются одинаково на обеих цепях двойной спиральной ДНК); каждый палиндром имеет два плеча, начиная с центральной точки, с симметрией в зеркале.

Палиндромы MSY, обозначенные как P1-P8, чрезвычайно велики, их длина составляет от 9 Кб (P7) до 1,45 Мб (P1); Благодаря своей особой структуре, ампликоновые последовательности подвергаются процессу рекомбинации, называемой конверсией генов - невзаимной передачей генетического материала между дублирующимися последовательностями в одной и той же хромосоме. Поскольку область MSY не участвует в кроссинговере X-Y во время мейоза, в ней отсутствует механизм замены мутаций или структурных перестроек нормальными последовательностями.

Предполагается, что явление конверсии генов между палиндромными последовательностями (Y-Y-рекомбинация) служит механизмом восстановления нормальных последовательностей, которые стали дисфункциональными на одном плече палиндрома.

Помимо сохранения целостности генов, эта необычная структура может служить структурной основой для делеций или перестроек; считается, что делеции являются результатом гомологичной рекомбинации между повторяющимися последовательностями, идентичными потере генетического материала.

Подавляющее большинство областей Y-хромосомы (57 из 60 Мб) имеют низкую скорость рекомбинации и передаются единым блоком от одного поколения к другому. Хромосомные маркеры с высокой мутагенной скоростью, такие как микросателлитные области, являются вариабельными во всех популяциях, и для определения гаплотипа можно использовать специфическую комбинацию аллелей. С использованием денатурирующей жидкостной хроматографии высокого давления (DHPLC) на Y-хромосоме человека было обнаружено 153 гаплотипа. Структура Y-хромосомы, обнаруженная в GenBank, относится к гаплотипу R1. Понятие гаплотипа важно, потому что люди с разными Y-гаплотипами могут иметь разные фенотипы (от нормальной до различной степени олигозооспермии), когда происходят микроделеции(7).

Большая часть генов в Y-хромосоме была идентифицирована относительно недавно и была разделена на три группы в зависимости от местоположения, количества копий и способа их экспрессии:

а) псевдоаутосомные гены, чьи последовательности идентичны на хромосомах X и Y (таких как ASMTL, MIC2, IL9R) ​​и которые в подавляющем большинстве случаев экспрессируются в различных тканях;
б) гены, расположенные в областях NRY, которые гомологичны хромосомам X и Y (USP9Y, DBY, UTY); эти гены экспрессируются повсеместно, хотя некоторые из них имеют специфичные для яичка продукты транскрипции;
в) Y-специфичные гены (DAZ, ​​CDY, TSPY); эти гены присутствуют у нескольких детей, широко распространены в Y-хромосоме или сгруппированы в небольшой области; выражены только в яичках. Исключением из этой классификации является ген SRY, который вызывает развитие яичка: хотя он специфичен для Y, он присутствует в единственном экземпляре и имеет другой способ экспрессии, который ограничен генитальным гребнем, клетками Сертоли (как плодом, так и у взрослых) и половых клеток
Согласно публикации авторов L. Tiepolo и O. Zuffardi (1976), в области MSY есть область, которая играет важную роль в сперматогенезе, удаление этой области связано с азооспермией и косвенно с бесплодием; эта область была сокращена AZF (Фактор Азооспермии) с местоположением Yq11.2313.

Тем не менее, генетическая сложность локуса AZF может быть выявлена ​​только после разработки STS-PCR (ПЦР сайтов с метками последовательностей) и методов гибридизации Southern Blot, которые позволили обнаружить субмикроскопические интерстициальные делеции (невидимые на цитогенетическом уровне - микроделеции). Исследования молекулярного картирования усложнили первоначальную гипотезу об уникальном локусе сперматогенеза Yq, предполагая существование 3 областей, которые могут страдать от делеций у бесплодных мужчин; эти 3 локуса были названы AZFa, AZFb и AZFc2 .

Гены AZFa Y важны во время эмбриогенеза и в период полового созревания, участвуя в дифференцировке сперматогонии; гены Y в AZFb и AZFc играют роль в полном созревании сперматогонии до стадии сперматозоидов, способной к оплодотворению15. В литературе упоминается, что пациенты, у которых полностью отсутствует область AZFa, не имеют половых клеток в эпителии яичка, при этом клинический диагноз - «синдром Сертоли-только-клеточный-синдром SCO» (11).

Наряду с делециями, которые происходят в одной из 3 областей AZFa, AZFb и AZFc, были описаны комбинированные делеции AZFbc, AZFabc, а также частичные делеции AZFc (называемые AZFc / gr / gr). Частота делеций у пациентов с необструктивной азооспермией различна для AZFα, AZFb, AZFc, AZFbc и AZFabc: 4,9%, 15,8%, 59,6%, 13,6% и <1% соответственно. Считается, что эти делеции происходят во время гаметогенеза или на ранней стадии предимплантации и могут включать дефицит ферментов, ответственных за восстановление нормальной ДНК(7).

Гены из региона AZFa

Диапазон AZFα, по оценкам, охватывает 792 т.п.н. в длину и включает два широко экспрессируемых функциональных гена: USP9Y (Y-связанную убиквитин-специфическую пептидазу 9) и DDX3Y (DEAD Box полипептид 3 Y-связанный), ранее известный как DBY. Точная роль генов в области AZFa еще не известна, поскольку спонтанные мутации, специфичные для одного гена, очень редки. Полная делеция области AZFa относительно редка (частота <2% у мужчин с дефектами сперматогенеза), но хорошо документирована и всегда связана с синдромом SCO3;

Ген USP9Y имеет длину 170 кб, содержит не менее 46 экзонов и кодирует белок, который функционирует как С-концевая убиквитин-гидролаза. Хотя считается, что делеция гена USP9Y связана с азооспермией и олигоспермией, недавнее исследование показало, что USP9Y не играет ключевой роли в производстве и фертильности сперматозоидов (это будет способствовать только эффективности этих процессов) (8).

DDX3Y может быть основным геном сперматогенеза в этом регионе, он чаще участвует в делециях, чем USP9Y, представляя наряду с повсеместно распространенными тканеспецифическими продуктами транскрипции яички. Ген включает 17 экзонов и кодирует АТФ-зависимую РНК-геликазу, но его роль в развитии зародышевых клеток макулина не полностью определена.

Гены из региона AZFb

Область AZFb включает гены EIF1AY (фактор инициации трансляции 1A, изоформа Y) и RBMY (мотив связывания РНК на Y). Роль гена EIF1AY в сперматогенезе до сих пор неизвестна, и о специфической делеции не сообщалось. Частичные делеции, включая локус RBMY, были связаны с исследованиями гипосперматогенеза, и полная делеция AZFb является частой причиной прекращения созревания сперматоцитов, что позволяет предположить, что семейство генов RBMY играет важную роль в сперматогенезе. только на уровне ткани яичка(14).

Гены из региона AZFc

AZFc - это область размером 3,5 Мб, делеция которой наиболее распространена у мужчин с азооспермией и олигозооспермией; содержит несколько семейств генов, участвующих в сперматогенезе, основным кандидатом в микроделеции является DAZ («исключено при азооспермии») 11; 14. DAZ имеет длину 48 кб, состоит как минимум из 16 экзонов и специфически экспрессируется в ткани яичка.

Комплекс из трех палиндромов, самый большой из которых имеет длину 3 Мб и 99,97% идентичности между его плечами, также включает регион AZFc, который часто страдает от делеции. При общей длине 4,5 Мб он содержит шесть отдельных семейств почти идентичных повторяющихся единиц (ампликонов). Ампликоны b, g, u, r и t имеют 4, 3, 3, 4 и, соответственно, 2 повторяющиеся последовательности в гаплотипе R1. Эти последовательности представляют собой прямые повторения, инвертированные повторения и палиндромы. AZFc содержит 12 семейств единиц транскрипции, причем все они экспрессируются в ткани яичка как BPY2, DAZ, CDY1, CSPG4LY, GOLGA2LY, TTTY3, TTTY4 и т. Д.

Микроделеции AZFc можно сгруппировать в несколько подтипов: полное удаление b2 / b4 и частичное удаление g1 / g2, r1 / r2 и r2 / r47.
Последние данные показывают, что частичные делеции AZFc происходят относительно часто; хотя некоторые изменения могут иметь клиническое значение, их вклад в мужское бесплодие не был полностью проанализирован(12).

Рекомендации по определению микроделеций Y-хромосомы - оценка мужчин с азооспермией, олигозооспермией или бесплодием неуточненной причины, чтобы установить прогноз и варианты лечения(10; 12).

Собранный образец - венозная кровь(6).
Контейнер для сбора  - вакуумный контейнер, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта(6).
Собранное количество - 5 мл крови.
Причины отторжения образца - использование гепарина в качестве антикоагулянта(6.)
Стабильность образца - 7 дней при 2-8ºC(6).
Метод - анализ методом мультиплексной ПЦР областей AZFa, AZFb, AZFc; с помощью этого теста можно обнаружить> 95% делеций из 3 областей AZF; используются специфические праймеры: sY84 и sY86 для области AZFα, sY127 и sY134 для области AZFb и SY254 и SY255 для AZFc6.

Интерпретация результатов

Микроделеции Y могут быть причиной дефекта сперматогенеза. Поскольку фертильность совместима с микроделециями Y (в зависимости от статуса женской фертильности, естественное оплодотворение может происходить при наличии небольшого количества сперматозоидов), более целесообразно рассматривать микроделеции Y как причину олиго-, азооспермии, чем причину мужского бесплодия(12).

Данные из литературы показывают, что соответствующие делеции Y обычно связаны с количеством сперматозоидов <1 × 106 / мл10.

Удаление всей области AZFa неизменно приводит к синдрому SCO и неспособности извлечь зрелую сперму из эпителия яичка для внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов.

Изолированная делеция генов USPY9 или DBY была связана с различными фенотипами яичек, которые не были подтверждены другими группами исследования.

Полные делеции AZFb и AZFbc характеризуются гистологической картиной SCO или остановкой созревания сперматогонии, состояниями, которые приводят к азооспермии. Как и при полной делеции AZFa, метод репродукции с помощью ИКСИ не рекомендуется для пациентов12. Их проконсультирует специалист, и могут быть рассмотрены альтернативные варианты ИКСИ (например, доноры спермы) (10).

Удаление области AZFc (b2 / b4) связано с переменным клиническим и гистологическим фенотипом и в целом совместимо с остаточным сперматогенезом. Делеции AZFc могут быть обнаружены у мужчин с тяжелой азооспермией или олигоазооспермией и, в редких случаях, могут передаваться потомству мужского пола. Пациенты с делециями AZFc также могут получить пользу от ИКСИ; их дети мужского пола будут иметь микроделеции AZFc12

Этот тест не выявляет все причины азооспермии или мужского бесплодия, поэтому отрицательный результат не исключает наличия генетического или негенетического фактора, определяющего клиническую картину.

Результаты тестов всегда следует интерпретировать с учетом клинического контекста пациента, истории болезни и других лабораторных данных. В редких случаях можно обнаружить полиморфизмы, которые могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам.

История аллогенной трансплантации костного мозга будет мешать тестированию(10).

Список используемой литературы
1. Эберхард Пассаж. Геномная структура X и Y хромосом. В Цветном атласе генетики, Георг Тиме Верлаг К.Г., 3-е издание, 2007, 256-257.
2. Foresta C, Моро E, Ферлин А. Микроделеции Y-хромосом и изменения сперматогенеза. In Endocrine Reviews, 2001, 22 (2): 226-239.
3. Главная генетика. Хромосома Ю. Тип ссылки: Интернет-коммуникации.
4. Елена Скалецкая и соавт. Мужской специфический регион человеческой хромосомы Y представляет собой мозаику классов дискретных последовательностей. В природе 423, 825-836 (19 июня 2003 г.)
5. Хантингтон Ф. Уиллард Биология генома: Рассказы о Y-хромосоме. В природе 423, 810-813 (19 июня 2003 г.).
6. Сыневская лаборатория. Конкретные ссылки на используемые технологии работы. 2010. Тип ссылки: Каталог.
7. Ли З., Хейнс С., Хан Я. «Микро-делеции» Y-хромосомы человека и их связь с мужским бесплодием. В J Genet. Genomics, 2008, 35: 193-199.
8. Лудди А., Марголличчи М., Гамбера Л., Серафини Ф., Сиони М., Де Лео В., Балестри П., Пиомбони П. Сперматогенез у человека с полной делецией USP9Y. В N Engl J Med. 2009 Фев 26; 360 (9): 881-5.
9. Мужское бесплодие. www.genecare.com. Тип ссылки: Интернет-связь.
10. Клиника Майо, Mayo Medical Laboratories. Справочные лабораторные службы для организаций здравоохранения. И Хромосомные Микроделеции, Молекулярное Обнаружение. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Тип ссылки: Интернет-связь.
11. Наварро-Коста П, Гонсалвес, Планча СЕ. Область AZFc Y-хромосомы: на перекрестке между генетическим разнообразием и мужским бесплодием. В гул. Reprod. Обновление, 2010, 1-18 марта.
12. Симони М., Баккер Э., Краус С. Рекомендации по наилучшей практике EAA / EMQN для молекулярной диагностики ишемических микроделеций. Состояние 2004 года. В Int J Androl 2004; 27: 240-9.
13. Тьеполо Л., Зуффарди О. Локализация факторов, контролирующих сперматогенез в нефлуоресцентной части длинной руки Y-хромосомы человека. В гул. Жене. 1976, 34: 119-124.
14. Фогт Л.С. Фактор азооспермии (AZF) в Yq11: к молекулярному пониманию его функции для мужской фертильности и сперматогенеза у мужчин. В RMB Online, 2005, 10 (1): 81-93.
15. www.klinikum.uni-heidelberg.de/AZ. Deletionen-унд-maennliche-Infertilitaet. Тип ссылки: Интернет-связь.
16.Y хромосома. http://universe-review.ca/R11-14-YChromosome.htm. Тип ссылки: Интернет-связь.