Расширенный профиль ANA + антигены Ku и Mi-2 - Блот

Системные аутоиммунные заболевания характеризуются наличием в повышенных титрах аутоантител по сравнению с внутриклеточными белками и нуклеиновыми кислотами. Эти аутоантитела в целом называются антиядерные антитела (ANA) из-за того, что они преимущественно нацелены на ядерные антигены, но они также включают антитела к цитоплазматическим антигенным мишеням.

Обнаружение ANA обладает высокой чувствительностью, поэтому считается лучшим скрининговым тестом на системные ревматические заболевания. Распространенность Ана при этих состояниях составляет от 20 до 100%. Для выявления ревматических заболеваний очень важна дифференциация ANA1; 2; 3. Таким образом, в настоящее время описаны две основные категории антиядерных антител:

1. Аутоантитела, которые имеют в качестве антигенной мишени ДНК и гистоны;
2. Аутоантитела, которые имеют в качестве мишени растворимые ядерные антигены(экстрактируемые ядерные антигены = ENA).

Разнообразие аутоантигенов-мишеней антиядерных антител чрезвычайно велико, поэтому при наличии положительного результата при обследовании с помощью непрямой иммунофлуоресценции необходимо выявить специфические антитела, которые направляют диагноз на конкретное аутоиммунное заболевание. Использование метода иммуноблотов дает преимущество тестирования расширенных профилей аутоантител, как в случае с профилем, выполненным в нашей лаборатории, который позволяет дифференцировать ANA по сравнению с 17 антигенами 4.

Антитела к U1-RNP/Sm направлены против некоторых антигенов, принадлежащих к группе Малых рибонуклеопротеинов (snRNP). Это комплексы, состоящие из РНК с высоким содержанием уридина (U-RNA) и различных белков, имеющих молекулярную массу 9-70 КДА. С помощью хроматографии были выделены 5 типов U-RNA: U1, U2, U4, U5 и U6. Частицы U-nRNP содержат 6 основных белков или Sm (B, B', D, E, F, G), а U1-RNP дополнительно содержит специфические белки (70k, A, C). Таким образом, антитела против U1 RNP реагируют с одним или несколькими специфическими белками, в то время как антитела против Sm реагируют с одним или несколькими ядерными белками. Действие snRNP имеет решающее значение для удаления интронов из пре-матричной РНК (процесс сплайсинга ), в результате чего мРНК будет экспортироваться из ядра и участвовать в процессе трансляции белков на уровне рибосом.

Повышенные титры антител к U1 RNP встречаются с распространенностью 95-100% при смешанной болезни соединительной ткани (синдром Шарпа), составляя один из диагностических критериев этого состояния. Титр антител также коррелирует со степенью активности заболевания. Антитела к U1 RNP также могут встречаться у пациентов с СКВ (15-40%), системным склерозом и полимиозитом 1;5.

Антитела к РС нацелены на антиген РС, названный так в честь первого пациента (Стефани Смит), у которого он был выделен. Антиген Sm является частью группы snRNP, участвующих в процессе сплайсинга информационной РНК. Антитела к РС встречаются у 5-40% пациентов с СКВ, имеющих высокую специфичность (более 90%) к волчаночной болезни.  Наряду с двухцепочечными анти-ДНК-антителами они могут считаться патогномоничными для этого клинического состояния и являются частью диагностических критериев ACR LES6.

Антитела к SS-A (Ro) направлены против антигена, который также является частью группы малых рибонуклеопротеинов (soluble substance A или Robert antigen).  Он состоит из молекулы РНК (Y1, Y2, Y3, Y4 или Y5) и белка 60 КДА. Комплекс также может связывать белок 52 КДА (Ro52) ,но это все еще вызывает споры в литературе. Различные исследования показали, что сыворотки, положительные по SS-A, всегда содержат антитела против нативного белка SS-A 60 КДА и, кроме того, могут также иметь антитела, направленные против белка Ro52. Дифференциация от антител к Ro52 имеет диагностическое значение, поскольку они неспецифичны и могут быть обнаружены при множестве состояний.

Антитела к SS-A связаны с различными аутоиммунными заболеваниями: синдромом Шегрена (40-95% случаев), СКВ (20-60%), примитивным билиарным циррозом (20%). Следует отметить, что эти аутоантитела встречаются в 100% случаев волчанки новорожденных. Они также могут встречаться при аутоиммунном или вирусном гепатите6.

Антитела к SS-B (La) направлены против белка, который играет роль в транскрипции РНК-полимеразы III (soluble substance B или Lane antigen). La, вероятно, представляет собой фактор завершения транскрипции, который связывается с 3'-концом вновь генерируемых продуктов транскрипции РНК-полимеразы III. Антитела к SS-B обычно появляются вместе с анти-SS-A, будучи связанными с теми же клиническими состояниями 1;3;4.

Анти-Ro52 к антигену 52 КДА и были описаны как неспецифические аутоантитела, связанные как с ревматическими, так и с не ревматическими заболеваниями. Они присутствуют в процентах 100% у матерей плода или новорожденных с врожденной Атрио-желудочковой блокадой или неонатальной волчанкой 1.

Антитела к Scl-70 направлены против негистонового белка 70 КДА, первоначально выделенного из ядер клеток печени, полученных от крыс. Впоследствии было показано, что этот белок является продуктом деградации ДНК-топоизомеразы I, класса ферментов, расположенных в нуклеоплазме и ядрышках, имеющих функцию поддержания информационной целостности ДНК (за счет способности расщеплять и объединять одну из двух цепей ДНК).

Антитела к Scl-70 обнаруживаются у 40% пациентов с системным склерозом диффузной формы и у 10% пациентов с системным склерозом ограниченной формы, являясь неблагоприятным прогностическим элементом 1;3;4;5.

Антитела к PM-Scl нацелены на белки ядерного комплекса PM-Scl, состоящего из 11-16 полипептидов, в которых антигенные компоненты имеют молекулярную массу от 20 КДА до 110 КДА. Основными антигенами являются 2 полипептида 75 и 100 КДА соответственно, известные как PM-Scl 75 и PM-Scl 100. 2 антигена не зависят друг от друга и не реагируют перекрестно. Этот белковый комплекс участвует в биосинтезе рибосом. Антитела к PM-Scl часто ассоциируются с синдромами склеродермии-полимиозита/дерматомиозита overlap 1;3;4; 5.

Антитела к Jo-1 направлены против фермента гистидил-Т-РНК-синтетазы. In vitro эти аутоантитела связываются с конформационными эпитопами фермента и ингибируют его каталитическую активность. Антиген находится в димерной форме и расположен в цитоплазме; молекулярная масса субъединиц составляет 50 КДА. Антитела к Jo-1 представляют собой серологический маркер дерматомиозита/полимиозита с распространенностью 20-40%. Наличие этих аутоантител связано с более тяжелой формой заболевания, зарезервированным прогнозом и более частыми рецидивами. Аутоантитела могут быть обнаружены на ранней стадии, иногда предшествуя появлению симптомов1; 3;4; 5.

Антитела к CENP B направлены против белка 80 КДА, расположенного в зоне закрепления волокон митотического веретена в ходе митоза. Все сыворотки, содержащие антицентромерные антитела, реагируют с CENP-B. антитела к CENP B представляют собой серологический маркер синдрома CREST, подтипа системного склероза (Распространенность 70-90%). Они также могут возникать у пациентов с примитивным билиарным циррозом1; 3;4; 5.

Антитела к PCNA (пролиферирующий ядерный клеточный антиген) направлены к белку 36 КДА, который составляет кофактор ДНК-полимеразы, и, таким образом, участвует в процессе репликации и репарации ДНК. Этот антиген также называют циклином I, который также играет роль в регуляции клеточного цикла. Внешний вид непрямой иммунофлуоресценции варьируется (зернистый/пятнистый), причем половина ядер клеток в интерфазе имеет низкую интенсивность. Анти-PCNA выявляются у 3% пациентов с SLE1;4.

Двухцепочечные антитела к ДНК реагируют с основными эпитопами нативной двухцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Эти антитела представляют собой маркер высокой специфичности для СКВ, присутствующий примерно у 60% (30-90%) пациентов с волчаночной болезнью. Он также представляет собой инструмент для мониторинга клинического течения этого заболевания, поскольку уровни антител к ДНК в сыворотке коррелируют со степенью активности заболевания (особенно при волчаночном нефрите). Они также могут ассоциироваться в уменьшенном проценте с лекарственно-индуцированной волчанкой, ревматоидным артритом и системным склерозом 1; 7.

Антитела к нуклеосомам

Нуклеопротеины (хроматин) состоят из 40% ДНК, 40% гистонов и 20% негистоновых белков. Гистоны организованы вдоль ДНК в повторяющиеся единицы, называемые нуклеосомами. Каждая нуклеосома состоит из ядра, содержащего 8 гистонов (2 класса H2A, 2 H2B, 2 H3 и 2 H4), и наматывается на 2 полных оборота последовательностью ДНК (165bp). Нуклеосомы связаны друг с другом сегментом свободной ДНК, имеющим форму шарика. Эта структура, удерживаемая гистоном H1, связывающим 2 соседних нуклеосом, обеспечивает 10-кратную упаковку ДНК. Антитела к нуклеосомам реагируют с открытой частью, то есть с ДНК в хроматине. Клинические исследования показали, что эти антитела появляются перед двухцепочечными антителами против ДНК у пациентов с LES7.

Антигистонные антитела реагируют против составляющих гистонов вместе с ДНК основных компонентов ядерного хроматина. Гистоны состоят из белков, богатых аминокислотами аргинином и лизином, и одной из их важных функций является участие в структурной организации хроматина в нуклеосомах .

Все пять классов гистонов (H1, H2A, H2B, H3, H4) в виде комплексов ДНК-гистонов могут быть мишенью для производства аутоантител. Антигистонные антитела встречаются примерно у 95% пациентов с лекарственно-индуцированной красной волчанкой и являются наиболее важным диагностическим критерием. Наиболее распространенными препаратами, участвующими в возникновении лекарственной волчанки, являются: прокаинамид, гидралазин, изониазид, карбамазепин, пеницилламин, хлорпромазин, Альфа-метилдопа, хинидин, салазосульфапиридин, миноциклин. Антигистоновые антитела могут сохраняться в течение многих лет после прекращения приема инкриминированного препарата.

Антигистоновые антитела также могут возникать при других состояниях, таких как СКВ и ревматоидный артрит1;3;8.

Рибосомные антитела к П-белку направлены против 3 рибосомных фосфопротеинов: P0 (38 КДА), P1 (19 КДА) и P2 (17 КДА). Эти антитела проявляют цитоплазматический патерн в непрямой иммунофлуоресценции и представляют собой маркер нейросенсорного нарушения при СКВ; они не коррелируют с активностью boli9.

Анти-митохондриальные антитела AMA M2 нацелены на субъединицу E2 комплекса пируватдегидрогеназы (PDC-E2). Повышенные титры приходят в поддержку диагностики примитивного билиарного цирроза (ПБК) и могут иметь прогностическую ценность для дальнейшего развития ПБК у пациентов с признаками холестаза. Анти-M2 также можно обнаружить при синдромах overlap примитивный билиарный цирроз-аутоиммунный гепатит (PBC-AIH), системный склероз (6%) и синдром Sjögren1;3;4.

Антитела к Mi-2 связываются с ядерным белковым комплексом и  состоят из нескольких компонентов. Описаны 2 белка антигена-мишени Mi-2: Mi2a (240 КДА) и Mi-2β (218 КДА). Хотя эти белки различны, они демонстрируют ряд мотивов геликазы и идентичных последовательностей, что позволяет предположить, что они будут выполнять ДНК-подобную функцию геликаз в ядре. Mi-2β образует белковый комплекс с гистон-деацетилазами (NuRD = нуклеосомный ремоделирующий комплекс деацетилазы) и участвует в регуляции экспрессии генов путем ацетилирования гистонов, вызывая ремоделирование структуры нуклеосом. Антитела к Mi-2 возникают у 10-30% пациентов с идиопатическими воспалительными миопатиями, особенно дерматомиозитом, которые связаны со специфическими кожными изменениями (такими как папулы Готтрона и гелиотропный Раш) и отсутствием повреждения легких. Большинство пациентов с антителами к Mi-2 являются носителями аллеля HLA DR7. Форма заболевания доброкачественная, с хорошим ответом на терапию кортизоном. Тем не менее, есть также случаи дерматомиозита с антителами к Mi2 (преимущественно Mi-2β), связанными с неоплазией (толстой кишки или молочной железы)9;10;11;12.

Антитела к Ku направлены против нуклеолярного белкового антигена гетеродимерного типа, состоящего из двух субъединиц с молекулярной массой 70 и 80 КДА соответственно, составляющих ДНК-зависимый ферментный комплекс протеинкиназы. Этот комплекс играет важную роль в клеточных процессах, связанных с трансляцией, репарацией ДНК и перестройкой генов, участвующих в синтезе иммуноглобулинов, а также рецепторов Т-клеток.  Антитела к Ku встречаются при широком спектре заболеваний соединительной ткани, особенно при синдромах склеродермии и миозита overlap, но также и при СКВ (3-10%). Появление в непрямой иммунофлуоресценции имеет гранулярный (пятнистый) тип;также была описана связь с аллелем HLA DQw1. Распространенность антител к Ku при аутоиммунных заболеваниях варьируется, важным элементом является этническое происхождение. Например, случаи СКВ, связанных с антителами к Ку, были описаны в Северной Америке и Европе, но не в Японии. Первичный синдром Шегрена, как и примитивная легочная гипертензия, представляет собой другие клинические состояния, обычно связанные с анти-Ku9; 12.

Рекомендации по определению расширенного профиля ANA + Mi-2 и Ku (Blot) - оценка пациентов с положительным тестом ANA IIF (непрямая иммунофлуоресценция) и клиническими признаками, указывающими на системное ревматическое состояние. Как правило, не рекомендуется проводить Блот-тест при наличии отрицательного результата ANA IIF, если у пациента нет явных клинических признаков ревматического заболевания и особенно синдрома Шегрена (тест ANA IIF иногда может быть отрицательным в присутствии антител к высокорастворимым антигенам, таким как SS-A/Ro, или к цитоплазматическим антигенам, недостаточно экспрессируемым на препаратах Hep-2 или других тканях, таких как Jo-1)2.

Добавление антигенов Mi и Ku к 15 пленкообразованным антигенам в расширенном профиле Blot ANA позволяет обнаруживать специфические аутоантитела по сравнению с разнообразной палитрой ядерных антигенов (ANA), что необходимо для выявления и подтверждения различных аутоиммунных заболеваний.

Таким образом, этот профиль может быть полезен при диагностике следующих аутоиммунных заболеваний:

1. Системная красная волчанка (СКВ)
2. Синдром Шарпа (заболевание смешанной соединительной ткани)
3. Синдром Шегрена
4. Системный склероз (SSc)
5. CREST синдром
6. Миозит (Поли/Дерматомиозит)
7. Ревматоидный артрит
8. Примитивный билиарный цирроз 9.

Подготовка пациента-натощак или после приема пищи (после еды)9.

Собранный образец-венозная кровь 9.

Контейнер для сбора материала-vacutainer без антикоагулянта с / без сепараторного геля 9.

Необходимая обработка после сбора материала - отделяем сыворотку центрифугом9.

Объем образца-минимум 0.5 мл сыворотки9.

Причины отторжения образца-сильно гемолизированная, липемическая или сильно зараженная бактерией сыворотка9.

Стабильность образца-отдельная сыворотка стабильна 14 дней при 4°c; более длительное время при -20 °C9.

Метод-иммуноблот. В тесте используются 17 нативных и рекомбинантных очищенных антигенов,которые фиксируются в параллельных чипах на мембране полосы. Антигены представлены в порядке фиксации на полосе:

Ми-2: рекомбинантный антиген
Ku: рекомбинантный антиген
nRNP / Sm: очищенный нативный антиген
Sm: очищенный нативный антиген
SS-A: очищенный нативный антиген
Ro 52: рекомбинантный антиген
SS-B: очищенный нативный антиген
Scl-70: очищенный нативный антиген
PM / Scl: рекомбинантный антиген
Jo-1: очищенный нативный антиген
CENP B: рекомбинантный антиген
PCNA: рекомбинантный антиген
DS DNA: очищенный нативный антиген
нуклеосомы: нативный антиген
гистоны: родной антиген
П-рибосомный белок: нативный антиген
AMA-M2: родной антиген

На первом этапе полоска, загруженная очищенными антигенами, инкубируется вместе с разбавленной сывороткой пациента. Если в сыворотке присутствуют специфические антитела, они будут связываться с соответствующими антигенами на полосе. После стадии промывки полоску инкубируют с конъюгатом против IgG человека, меченным щелочной фосфатазой. Конъюгат присоединится к части IgG комплекса антиген-антитело. После промывочного удаления несвязанного конъюгата добавляют окрашивающий раствор (субстрат фермента) – колориметрическую систему обнаружения ферментов. Если связанный конъюгат присутствует ферментативная реакция будет генерировать темно-синий цветной продукт на уровне полос, занятых специфическими антителами. Таким образом, полосы, визуализированные на уровне полосы, являются результатом связывания специфических антител с отдельными антигенами на уровне полосы.

На каждой полосе есть внутренняя контрольная полоса. Возникновение интенсивной цветовой реакции на этом уровне подтверждает, что все этапы иммуноблот-теста были выполнены правильно.9.

Контрольные значения и интерпретация результатов

Окончательная интерпретация результатов теста выполняется с помощью программного обеспечения (после сканирования полос), которое в зависимости от интенсивности сигнала дает оценку для каждой полосы полосы полосы, например:

Референтные значения

• MI-2: негативный
• Ku: негативный
• nRNP/Sm: негативный
• Sm: негативный
• SS-A: негативный
• Ro 52: негативный
• SS-B: негативный
• Scl-70: негативный
• PM/Scl: negativ
• Jo-1: негативный
• CENP B: негативный
• PCNA: негативный
• ds DNA: negativ
• nucleozomi: негативный
• histone: негативный
• proteina P-ribozomala: негативный
• AMA-M2: негативный

Библиография

1. Carlos Alberto von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry´s Clinical Diagnosis and Management By  Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 924-928.
2. Tozzoli et al. Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diseases. In Am Clin J Pathol 2002, 117, 316-324.
3. van Venrooji WJ et al. The consensus workshop for the detection of autoantibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. In J Immunol Methods 5 (1991), 181-189.
4. Yashwant Kumar et al. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. In Diagnostic Pathology, 2009, 4:1.
5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com  2016. Ref Type: Internet Communication.
6. Soto ME, et al. Gender impact in systemic lupus erythematosus. In Clin Exp Rheumatol 22 (2004), 713-721.
7. Haugbro K, et al. Anti-dsDNA antibodies and disease classification in antinuclear antibody positive patients: the role of analytical diversity. In Ann Rheum Dis 63 (2004), 386-394.
8. EUROIMUN AG. Schlumberger W, et al. Diagnostic relevance of autoantibodies against nucleosomes. In Autoimmunity Reviews (2002), 32.
9. Laborator Synevo. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2016. Ref Type: Catalog
10. Nakashima R, Mimori T. Significance of Myositis-Specific and Myositis-Associated Autoantibodies: Myositis-specific Autoantibodies. www.medscape.org. 2010.
11. Ghirardello A, Borella E, Beggio M, Franceschini F, Fredi M, Doria A. Myositis autoantibodies and clinical phenotypes. Auto Immun Highlights. 2014 Dec; 5(3): 69–75.
12. Ruxandra Ionescu. Boli inflamatoare musculare. În Esențialul în Reumatologie, Editura Amaltea, 2007, 399-408