Профиль системного склероза - блот

Синдром CREST представляет собой подтип системного склероза, клинически характеризующийся: кальцификацией кожи, синдромом Рейно, нарушениями моторики пищевода, склеродактилией и телеангиэктазиями.

Критерии классификации, разработанные ACR (Американский колледж Ревматологии) для системного склероза, следующие:

1. Главный критерий: поражение кожи, которое проходит проксимально к пястно-фаланговым или плюснефаланговым суставам;
2. Незначительные критерии: склеродактилия; эрозивные рубцы пульпы пальца; двусторонний базальный фиброз легких.

Для постановки диагноза необходимо представить основной критерий или два второстепенных критерия 2;3. Поскольку критерии ACR были разработаны с целью классификации, а не диагностики, на практике общеприняты критерии Лероя и Медсгера, которые демонстрируют повышенную чувствительность и позволяют поставить предварительный диагноз 4:

ANA-непрямой иммунофлуоресцентный тест положительный у ≥ 90% пациентов со склерозасистемой. Определение специфических аутоантител является важным элементом серологической диагностики системного склероза (в том числе на ранних стадиях), мониторинга прогрессирования заболевания, прогностической оценки и дифференциации от других коллагенозов1.

Антитела к Scl-70 направлены против негистонового белка 70 КДА, первоначально выделенного из ядер клеток печени, полученных от крыс. Впоследствии было показано, что этот белок является продуктом деградации ДНК-топоизомеразы I, класса ферментов, расположенных в нуклеоплазме и ядрышках, имеющих функцию поддержания информационной целостности ДНК (за счет способности расщеплять и объединять одну из двух цепей ДНК).

Антитела к Scl-70 обнаруживаются у 40% пациентов с системным склерозом диффузной формы и у 10% пациентов с системным склерозом ограниченной формы. Наличие Scl-70 в большинстве случаев связано с тяжелым и быстрым прогрессированием заболевания, с обширным поражением кожной территории и внутренних органов.

Как и в случае антицентромерных антител наличие антител к Scl-70 у пациентов с синдромом Рейно может быть прогностическим фактором для дальнейшего развития системного склероза. Антитела к Scl 70 связываются с аллелем DRB1*11 во всех этнических группах 1;2;3.

Антицентромерные антитела были описаны с характерным паттерном один раз с введением субстрата Hep2 в метод непрямой иммунофлуоресценции, что было невозможно с использованием тканей животных. Антитела направлены против 6 центромерных белков (A-F), расположенных в области закрепления волокон митотического веретена в ходе митоза. Все сыворотки, содержащие антицентромерные антитела, реагируют с CENP-B (80 КДА).

Антитела к CENP B представляют собой серологический маркер синдрома CREST, подтипа системного склероза (Распространенность 70-90%). Этот тип аутоантител также может возникать при синдроме Рейно и билиарном циррозе

Клинические исследования показали, что у пациентов с системным склерозом, имеющих антицентромер–положительные и анти-Scl 70-отрицательные антитела, выживаемость через 10 лет значительно выше. В целом, наличие антицентромерных антител вызывает лучший прогноз заболевания, чем другие аутоантитела, связанные с системным склерозом. Частота антицентромерных антител у пациентов с системным склерозом может варьироваться в зависимости от этнического происхождения (повышенное у европеоидов, низкое у латиноамериканцев и афроамериканцев)1;3;5.

Антитела  к РНК-полимеразы III (RNAP III) встречаются вместе с анти-RNAP I и анти-RNAP II у 20% пациентов с системным склерозом, имеющих диагностическое и прогностическое значение. Однако специфичность анти-RNAP III и RNAP I схожа лучше, чем у антител против RNAP II, причем последние могут встречаться при синдромах типа overlap LES/системном склерозе. Антитела против RNAP I и анти-RNAP III всегда сосуществуют. Антитела против RNAP чаще встречаются в диффузной форме системного склероза и направлены против некоторых ядрышковых и ядерных белков. Комплекс RNAP I расположен в ядрышках, а белки RNAP II и III находятся в нуклеоплазме.

Антитела к фибриларину (анти-U3RNP) направлены против белка 34 КДА, субъединицы семейства белков snRNP (небольших ядерных рибонуклеопротеинов), участвующих в обработке информационной РНК. Антифибрилляринные антитела встречаются примерно у 4% пациентов с системным склерозом, специфичны для диффузной формы заболевания и связаны с проявлениями миозита, легочной гипертензии и повреждения почек.

Эти аутоантитела также были описаны у пациентов с СКВ, смешанным заболеванием соединительной ткани и синдромом Рейно.

Антитела к Th / To были идентифицированы совсем недавно и направлены против компонентов РИБОНУКЛЕОПРОТЕАЗЫ MRP и комплекса рибонуклеазы P, которые находятся на уровне ядрышка. Антитела Th / To присутствуют у 2-5% пациентов с системным склерозом, чаще встречаются в японской популяции. Эти антитела также были описаны у пациентов с СКВ, синдромом Рейно и полимиозитом. Антитела к Th / To обычно не связываются с антицентромерными антителами 1;2.

Антитела к NOR 90 распознают компонент 90 КДА хромосомной области, вокруг которой образуется ядрышко (nucleolus organizer region). Антиген NOR 90 также был описан как hUBF (фактор связывания верхнего потока человека) с 2 изоформами - фактором транскрипции РНК-полимеразы I. анти-NOR 90 встречаются у пациентов с системным склерозом, синдромом Рейно, СКВ, ревматоидным артритом и различными злокачественными новообразования2.

Антитела к PM-Scl нацелены на белки ядерного комплекса PM-Scl, состоящего из 11-16 полипептидов, в которых антигенные компоненты имеют молекулярную массу от 20 КДА до 110 КДА. Основными антигенами являются 2 полипептида 75 и 100 КДА соответственно, известные как PM-Scl 75 и PM-Scl 100. 2 антигена не зависят друг от друга и не реагируют перекрестно. Этот белковый комплекс участвует в биосинтезе рибосом. Антитела против PM-Scl часто ассоциируются с синдромами склеродермии-полимиозита/дерматомиозита overlap.

Антитела к Ku направлены против нуклеолярного белкового антигена гетеродимерного типа, состоящего из двух субъединиц с молекулярной массой 70 и 80 КДА соответственно, составляющих ДНК-зависимый ферментный комплекс протеинкиназы. Этот комплекс играет важную роль в клеточных процессах, связанных с трансляцией, репарацией ДНК и перестройкой генов, участвующих в синтезе иммуноглобулинов, а также рецепторов Т-клеток.  Антитела против Ku встречаются при широком спектре заболеваний соединительной ткани, особенно при синдромах склеродермии и миозита overlap, а также при СКВ (3-10%). Появление непрямой иммунофлуоресценции имеет гранулярный (пятнистый) тип; также была описана связь с аллелем HLA DQw1. Распространенность антител против Ku при аутоиммунных заболеваниях варьируется, важным элементом является этническое происхождение. Например, случаи СКВ, связанных с антителами против Ку, были описаны в Северной Америке и Европе, но не в Японии. Первичный синдром Шегрена, как и примитивная легочная гипертензия, представляет собой другие клинические состояния, обычно связанные с анти-Ku1; 2.

Антитела к PDGFR

PDGFR (platelet derived growth factor receptor) являются поверхностными рецепторами тирозинкиназы для членов семейства PDGF - факторов, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку, рост и развитие клеток. PDGFR играют важную роль в развитии эмбриона и способствуют поддержанию соединительной ткани у взрослых. Нарушение регуляции сигнала PDGFR приводит к атеросклерозу, легочной гипертензии и фиброзу органов. Фиброз возникает в результате чрезмерного отложения внеклеточного матрикса в результате активации фибробластов (клеток мезенхимальной природы). PDGF способствует расширению фибробластов, поэтому в фиброзных поражениях обнаруживаются повышенные уровни PDGF. Антитела против PDGFR были описаны у пациентов с системным склерозом 2.

Антитела к Ro52 направлены против белка 52 КДА. Эти антитела неспецифичны; они могут возникать как при аутоиммунных, так и при инфекционных заболеваниях с распространенностью 5-81% 1;2.

В таблице ниже упоминается чувствительность и специфичность различных типов аутоантител к системному склерозу 2:

Рекомендации-пациенты с клиническим подозрением на системный склероз и положительным результатом теста ANA-непрямая иммунофлуоресценция 1;2.

Подготовка пациента - натощак или после приема пищи (после еды)2

Собранный образец-венозная кровь 2.

Контейнер для сбора материала-vacutainer без антикоагулянта с / без сепараторного геля 2.

Необходимая обработка после сбора материала - отделяем сыворотку центрифугом2.

Объем образца-минимум 1 мл сыворотки 2.

Причины отказа от образца:

* гемолизированный образец;
* желтушный, липемический образец;
* бактериально загрязненный образец 2.

Стабильность образца-отдельная сыворотка стабильна 14 дней при 2-8ºC и длительное время при-20ºC. Не размораживайте/не замораживайте 2.

Метод-иммуноблот. В тесте используются 13 очищенных нативных и рекомбинантных антигенов,которые фиксируются в параллельных чипах на мембране полосы. Антигены представлены в порядке фиксации на полосе:

- Scl-70: очищенный нативный антиген
- CENP A: рекомбинантный антиген
- CENP B: рекомбинантный антиген
- RP 11: рекомбинантная субъединица РНК-полимеразы III
- Rp 155: : рекомбинантная субъединица РНК-полимеразы III
- Фибриларин: рекомбинантный антиген
- NOR 90: рекомбинантный антиген
- Th/To: рекомбинантный антиген
-Pm-Scl 100: рекомбинантный антиген
-Pm-SCL 75: рекомбинантный антиген
- Ку: рекомбинантный антиген
- PDGFR: рекомбинантный антиген
- Ro 52: рекомбинантный антиген

На первом этапе полоска, загруженная очищенными антигенами, инкубируется вместе с разбавленной сывороткой пациента. Если в сыворотке присутствуют специфические антитела, они будут связываться с соответствующими антигенами на полосе. После стадии промывки полоску инкубируют с конъюгатом против IgG человека, меченным щелочной фосфатазой. Конъюгат присоединится к части IgG комплекса антиген-антитело. После промывочного удаления несвязанного конъюгата добавляют окрашивающий раствор (субстрат фермента) – колориметрическую систему обнаружения ферментов . Если связанный конъюгат присутствует ферментативная реакция будет генерировать темно-синий цветной продукт на уровне полос, занятых специфическими антителами. Таким образом, полосы, визуализированные на уровне полосы, являются результатом связывания специфических антител с отдельными антигенами на уровне полосы.

На каждой полосе есть внутренняя контрольная полоса. Возникновение интенсивной цветовой реакции на этом уровне подтверждает, что все этапы иммуноблот-теста были выполнены правильно.2.

Контрольные значения и интерпретация результатов:

Окончательная интерпретация результатов теста выполняется с помощью программного обеспечения (после сканирования полос), которое в зависимости от интенсивности сигнала дает оценку для каждой полосы полосы полосы, например:

Библиография