Типирование генов HLA-DR (ПЦР)

Общая информация

Генетика основного комплекса гистосовместимости

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) представляет собой генную группу, расположенную на короткой руке хромосомы 6, которая производит поверхностные клеточные маркеры, которые играют важную роль в процессе распознавания: молекулы класса I и класса II. У людей молекулы MHC класса I включают лейкоцитарные антигены (HLA = антиген лейкоцитов человека) HLA-A, HLA-B и HLA-C, тогда как молекулы MHC класса II включают HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Эти молекулы составляют классические антигены, участвующие в трансплантации. На уровне MHC также кодируются молекулы класса III: MHC-связанные компоненты комплемента (C2, C4 и Bf), 21-гидроксилаза (CYP21), высокочувствительный белок (Hsp) 70 и фактор некроза опухоли (TNF).

MHC растягивается в длину 3600 кб и включает в себя 224 идентифицированных гена, из которых прогнозируется экспрессия в количестве 128; около 40% экспрессируемых генов имеют функцию, связанную с иммунной системой. Гены HLA расположены в 6 суб-областях, которые следуют друг за другом в следующем порядке: HLA-A, HLA-C, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-A дистально от центромеры. Каждая субрегиона кодирует по крайней мере один поверхностный гликопротеин (см. Рисунок 1).

Рисунок 1: последовательность генов HLA I и II на хромосоме 6

За одним исключением, гены HLA характеризуются высоким полиморфизмом, точнее, каждый ген показывает несколько аллелей в популяции. Учитывая важную роль системы HLA в иммунном ответе, представляется, что этот полиморфизм необходим для выживания видов и сохраняется в популяции путем отбора.

Гены MHC тесно связаны друг с другом, что означает массовую сегрегацию в ходе мейоза. Комплекс связанных генов, которые расположены на одной из пар гомологичных хромосом и которые массово сегрегируют у потомства, называется гаплотипом. Каждый человек наследует два гаплотипа HLA-по одному от каждого родителя-и, таким образом, имеет два аллеля для каждого гена, экспрессирующего кодоминант (см. Рисунки 2,3).

Рисунок 2: аллели-унаследованные пары от мамы и папы для каждого локуса HLA

Наблюдение, что аллели в различных генетических локусах встречаются в популяции в пределах одного и того же гаплотипа, причем частота значительно выше, чем предполагалось только на случайной основе, определяет дисбаланс связей – особенность системы HLA – которая простирается от HLA-A до HLA-DQ включительно. Наиболее известным дисбалансом связи является гаплотип A1, Cw7, B8, DR17(3), DR52, DQ2, встречающийся в европеоидной популяции с частотой, в 4 раза превышающей ожидаемую 2.

Рисунок 3: Как передаются гаплотипы HLA детям семьи

Роль молекул HLA класс I и II

Классические молекулы, относящиеся к классу I MHC, называемые у людей HLA-A, HLA-B и HLA-C, представляют собой гетеродимеры, состоящие из гликозилированного трансмембранного полипептида, связанного с β2-микроглобулином, который экспрессируется на всех ядросодержащих клетках и владеет ключевые роли в иммунном ответе:

● Показывает пептидные антигены, полученные из цитоплазматических белков ( например, вирус или аномальный белок в злокачественной клетке) клональных рецепторов, специфичных для каждого пептида CD8+Т-лимфоцитов. Эти пептиды возникают в результате переваривания белков на уровне лизосом, обычно их длина составляет около 9 аминокислот. Каждый аллотип MHC I выбирает свои собственные Т-клетки; таким образом, существует 6 подмножеств Т-клеток, каждая из которых специализируется на аллотипах HLA-A, HLA-B и HLA-C материнского или отцовского происхождения. После распознавания пептидов CD8 + Т-клетки лизируют клетки-мишени.

● Их экспрессия на поверхности клеток выполняет защитную функцию в врожденном иммунном ответе, предотвращая лизацию клеток-мишеней NK-клетками (”естественный убийца"). В частности, NK могут распознавать и лизировать клетки-мишени, которые не экспрессируют молекулы HLA класса I на своей поверхности, тем самым играя важную роль в надзоре против вирусов и опухолевых клеток. Уровень экспрессии молекул HLA класса I на поверхности клеток максимален на лимфоидных клетках; в ходе иммунного ответа экспрессия увеличивается под действием цитокинов (интерферон γ и TNF); с другой стороны, опухоли и некоторые вирусы (например, ВИЧ) могут подавлять экспрессию HLA I.

Наряду с классическими генами в область MHC I также включены гены со сниженным полиморфизмом, обозначенные как HLA-E, HLA-F и HLA-G2;8.

Молекулы, относящиеся к классу II MHC, HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP, представляют собой гетеродимеры, состоящие из двух нековалентно связанных трансмембранных гликопротеинов – α-цепи (33-35 КДА) и β-цепи (26-28 КДА).

Каждая из 3 субрегионов, DR, DQ и DP, включает по крайней мере один ген A (который кодирует α-цепь) и один ген B (который кодирует β-цепь). Субрегион DR кодирует одну или две молекулы DR, в зависимости от гаплотипа. Он содержит один экспрессируемый ген DRA, который похож на несколько гаплотипов. Ген DRB, наиболее близкий к центромеру, DRB1, кодирует высоко полиморфную β-цепь, которая, связанная с α-цепью, образует молекулу класса II, которая преобладает на поверхности клеток и которая экспрессирует серологические специфичности DR1-DR18. Второй экспрессируемый ген DRB, который присутствует только в определенных гаплотипах, локализуется между локусами DRB1 и DRA и, в зависимости от экспрессируемых аллелей DRB1, называется DRB3, DRB4 или DRB5. Полученные молекулы DR имеют серологические особенности DR52, DR53 и DR51 соответственно. Субрегион DQ включает полиморфные гены DQA1 и DQB1, которые кодируют гетеродимер DQ ce, несущий серологические специфичности DQ1-9. Субрегион DP содержит 2 набора генов A и B: набор dpa1 и dpb1 с высоким полиморфизмом кодирует белковый продукт DP; другой набор состоит из псевдогена 2.

В отличие от молекул класса I, молекулы класса II экспрессируются только на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC): моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, В-лимфоцитов и, кроме того, на активированных Т-лимфоцитах и эпителиальных клетках

Молекулы класса II показывают CD4 + хелперные Т-лимфоциты пептидные антигенные фрагменты, обработанные из экзогенных антигенов, таких как бактерии. Антигенные рецепторы CD4 + Т-лимфоцитов взаимодействуют с антигенным фрагментом комплекса-молекулами HLA класса II и вызывают активацию клеток. Как и в случае с классом I, распознавание антигенного фрагмента эффекторными Т-клетками зависит от полиморфизма аллелей MHC. Таким образом, эффекторная Т-клетка специфична для антигенного пептида в сочетании с конкретным аллельным продуктом класса II, который первоначально представлял антиген (ограничение MCH). После распознавания антигена каждая активированная CD4+ Т-клетка стимулирует дифференцировку в-клеток в продуцирующие антитела плазмоциты и способствует дифференцировке других Т-лимфоцитов в цитотоксические клетки или с супрессорными функциями.

Рисунок 7: представление антигенных фрагментов Т-клеток молекулами HLA I и II, экспрессируемыми на APC

Atat moleculele de clasa I cat si cele de clasa II pot lega alternativ peptide proprii („self”) provenite din degradarea fiziologica a proteinelor celulare. In mod obisnuit acestea nu declanseaza activarea limfocitelor T deoarece sunt tolerate de sistemul imun individual; in unele situatii insa se pot declansa reactii imune care initiaza un proces de distrugere a self-ului ce conduce la autoimunitate².

Как молекулы класса I, так и молекулы класса II могут поочередно связывать собственные пептиды („self”), возникающие в результате физиологической деградации клеточных белков. Обычно они не вызывают активацию Т-лимфоцитов, потому что они переносятся отдельной иммунной системой; однако в некоторых ситуациях могут быть вызваны иммунные реакции, которые инициируют процесс самоуничтожения, приводящий к аутоиммунитету 2.

Номенклатура HLA

Номенклатура HLA разработана комитетом ВОЗ, созданным для этого. Первоначальная идентификация молекул HLA включала использование аллозеров человека, полученных в результате аллоиммунизации, полученной во время беременности, или выполнения различных трансплантаций. Таким образом, возникающая в результате номенклатура отражает историю этих усилий по открытию, которые устанавливаются в рамках международных семинаров. Аллотипы были обозначены числами, такими как HLA-A2, HLA-B27 и HLA-Cw6, а числа антигенов HLA-A и HLA-B не перекрываются (см. Рисунок 4). Буква "w", первоначально использовавшаяся для обозначения определенной категории семинаров, была сохранена для аллотипов HLA-C с целью отличить их от компонентов комплемента C2 и C4, которые также отображаются в MHC8.

Рисунок 4: Серологический анализ Tipaj HLA

При серологическом тестировании некоторые аллозеры взаимодействуют с более чем одним аллельным продуктом HLA, явление, называемое инкрустированной реактивностью. В случае аллельных продуктов, соответствующих локусам HLA-A и HLA-B, это явление было тщательно изучено и использовано для классификации молекул на антигенные группы, которые реагируют инкрустированно (CREGs). Молекулы класса I в CREG имеют один или несколько антигенных детерминант, которые не восстанавливаются на уровне молекул другого CREG. Антигенный детерминант (эпитоп), который встречается у членов CREG, называется общественной специфичностью (например: HLA-Bw4 и HLA-Bw6)2.

Серологические методы HLA-типа все чаще заменяются методами молекулярной биологии (электрофорез нуклеиновых кислот, методы гибридизации, а также секвенирование), которые привели к изменению номенклатуры с учетом аллелей ДНК. Таким образом, одна серологически определенная специфичность может быть выражена двумя или более (>25) различными аллелями (см. Рисунок 5).

Рисунок 5: типаж HLA-от серологии до молекулярной биологии

В номенклатуре на основе ДНК каждый аллель HLA обозначается названием локуса гена, за которым следует Звездочка * и 4-7-значным числом, указывающим на аллель (например, a*0201 является аллелем гена HLA-A, А B*2701 является аллелем гена HLA-B). Первые 2 цифры в названии каждого аллеля часто основаны на серологическом типе полученной молекулы и/или сходстве нуклеотидных последовательностей с другими аллелями в группе (см. Рисунок 6).

Рисунок 6: тип HLA через молекулярную биологию

Некоторые аллели отличаются последовательностью экзонов ДНК, но не полученной аминокислотной последовательностью (из-за молчаливых или синонимичных замен); эти аллели идентифицируются путем добавления 5-й цифры к 4 общим цифрам (например, B*27051 и B*27052). Кроме того, цифры 5-7, добавленные в обозначение, указывают на то, что 2 аллеля отличаются только последовательностями на уровне интронов (например, DRB4* 0103101 и DRB4* 0103102). В данном примере DRB4* 0103102 показывает сайт сплайсинга модифицированной РНК, который приводит к потере экспрессии аллеля; аллели, которые не экспрессируются как белки, могут иметь N, добавленный к их названию (например, A*215N и DRB4* 0103102n)2;3.

В отличие от серологических методов, HLA-типирование на основе ДНК показывает чистый преимущества:

● он специфичен (каждый реагент для набора четко определен и основан на определенной нуклеотидной последовательности);

● он гибкий (по мере открытия новых аллелей можно получать новые реагенты);

● он более надежен, чем другие методы (не требует жизнеспособных лимфоцитов);

● может широко применяться;

● может различать аллели ДНК, которые специфичны для белков HLA, которые не могут быть дифференцированы серологически; например, человек, представляющий аллель DRB1* 0401, имеет тот же серологический тип DR4, что и человек, который является носителем аллеля DRB4* 04122.

Молекулярные методы идентифицированы в настоящее время 4447 аллелей HLA класса I и II: 965 HLA-A, 1543 HLA-B, 626 HLA-C, 9 HLA-E, 21 HLA-F, 46 HLA-G, 855 HLA-DRB, 35 HLA-DQA1, 107 DQB1, 28 HLA-DPA1, 138 HLA-DPB3. Новые обнаруженные аллели представлены в периодических отчетах комитета ВОЗ, а нуклеотидные последовательности всех аллелей хранятся в компьютерной базе данных (GenBank, EMBL, IMGT/HLA databases)2.

С апреля 2010 года вступает в силу изменение номенклатуры HLA: в результате увеличения количества аллелей HLA было решено ввести": "в название аллелей для разграничения отдельных полей. Таким образом:

A*01010101  → A*01:01:01:01

A*260101 →A*26:01:01

A*3301 → A*33:01

B*0808N → B*08:08N

DRB1*01010101 → DRB1*01:01:01:01

Также ожидаются другие изменения, в том числе то, что буква „w” будет вычтена из названия аллелей HLA-C, но будет сохранена в антигенах HLA-C4.

Заболевания, связанные с системой HLA

Существует значительное количество состояний, которые демонстрируют связь с генами MHC; в большинстве случаев это аутоиммунные заболевания, которые не имеют классического Менделевского способа передачи.  Например, анкилопоэтический спондилит связан в 95% случаев с HLA-B27.

Одной из основных проблем, связанных с ассоциациями генов MHC, является их неполная пенетрантность, что делает официальные исследования сегрегации и линкинга очень трудными, если не невозможными, для выполнения. Другим неизвестным является количество аллелей, предрасполагающих к определенному заболеванию в конкретной популяции; кажется, что многие заболевания, связанные с системой HLA, являются полигенными.

Генетическая ассоциация отражена в термине "относительный риск", который представляет собой статистическое соотношение между индивидуальным риском заболевания у носителей генетического маркера и риском у людей тех же групп населения, у которых нет этого маркера. Относительный риск выше 1 указывает на положительную связь между HLA и этим заболеванием 6.

Среди состояний, связанных с HLA, которые были тщательно изучены, есть сахарный диабет 1 типа. Самая сильная связь - это аллели класса II HLA DR и DQ. Гетерозиготный генотип DR3 / DR4 повышает риск развития диабета, за которым следуют гомозиготные генотипы DR4 и DR3.

У европеоидной расы гетеродимеры HLA-DQ (Альфа-цепи DQA1 и бета-цепи DQB1), кодируемые аллелями DQA1*0301, DQB1*0302, DQA1*0501, DQB1*0201, демонстрируют наибольшую связь с диабетом 1 типа. Было отмечено, что DQB1*0302 отличается от DQB1*0301 в положении 57, где отсутствует остаток аспарагиновой кислоты. Такое же отсутствие аспарагиновой кислоты в положении 57 также происходит в аллеле DQB1*0201, и было высказано предположение, что остальная аминокислота будет участвовать в молекулярном механизме восприимчивости к диабету3.

Другие гаплотипы генов HLA класса II играют защитную роль в развитии диабета: DQA1*0102/DQB1*0602/DRB1*1501. В частности, аллель DQB1*0602 обеспечивает защиту даже у родственников пациентов с диабетом первой степени, у которых присутствуют антитела к островковым клеткам поджелудочной железы9.

Абсолютный риск развития диабета 1 типа в зависимости от генотипа HLA показан в таблице ниже 1:

DR3/DR3	1/125
DR3/DRX	1/500
DR4/DR4	1/147
DR4/DRX	1/476
DR3/DR4	1/42
DRX/DRX	1/5565

Тестирование HLA полезно для оценки риска развития диабета у людей с положительным семейным анамнезом.

Пациенты с маркерами HLA dqb1 * 0201 и / или *0302 или предрасполагающими аллелями DR4 (DRB1*0405, DRB1*0402) должны наблюдаться биохимически и иммунологически 5.

В результате внедрения методов на основе ДНК в тип HLA были выявлены некоторые четкие связи между прогрессированием инфекции ВИЧ-1 до синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и некоторыми антигенами HLA класса II. Таким образом, в настоящем HLA-B27 наблюдается отсутствие прогрессирования до долгосрочного СПИДа, тогда как связь с HLA-B35 обозначает быстрое прогрессирование. Разница между двумя аллелями заключается в различном количестве вирусных пептидов, которые могут связываться с 2 экспрессируемыми молекулами HLA-B; молекула HLA-B27 связывает 15 различных типов пептидов, происходящих из оболочки вируса, тогда как ни один вирусный пептид не содержит аминокислотных последовательностей, которые предпочтительно связываются с HLA-B35. Следовательно, загрузка молекул HLA пептидами с целью представления антигена представляет собой критическую стадию. ВИЧ-инфекция контролируется CD8+ Т-клетками в течение переменного периода времени; размер этого периода зависит от количества распознанных вирусных пептидов 8.

Что касается связи HLA с боррелиозом, согласно данным литературы сообщается:

– HLA, связанные с рефрактерной болезнью Лайма при лечении, то есть с аутоиммунитетом, вызванным патогеном:

DR1 (HLA-DRB1*0101)

DR2 (HLA-DRB1*1501)

DR4 (HLA-DRB1*0401,*0402,*0403,*0404,*0405,*0407)

– HLA, связанные с низкой выработкой специфических антител Borrelia при наличии определенной инфекции:

alele DR1 (HLA-DRB1*0101,*0102,*0103,*0104,*0105).

В заключение, определение антигенов HLA может быть использовано сегодня в качестве маркера для дифференциальной диагностики многих состояний. В таблице ниже приведены примеры состояний, связанных с определенными созвездиями HLA, наряду с относительным риском заболеваний.

Заболевание	Антиген HLA	Относительный риск
Аллергия на латекс	DR4, DQB1*0302 (DQ3)	2.4
Аллергия на инсулин	B7, B21	5.4
Очаговая алопеция	B12	5.4
Экзогенный аллергический альвеолит	DR6	16.5
Апластическая анемия	DR2	2.2
Пагубная анемия	DR5	5.4
Хронический ювенильный артрит	DR8 DR5	8.0 3.3
Псориатический артрит	B27 B38	10.7 9.1
Реактивный артрит-инфекции: Шигелла, Иерсиния, сальмонелла	B27	40.0
Артрит Лайма (инфекция Боррелиоз)	DR2/DR4	22.0
Аспириновая астма	DQ2	4.1
Болезнь Аддисона (идиопатическая)	DR3	6.3
Болезнь Альцгеймера	B7/Cw3	28.0
Базедова болезнь	DR3	4
Болезнь Бехчета	B51	6.3
Болезнь Бехчета( мукокутанный)	B12	5.6
Болезнь Бехтерева	B27	87.4
Целиакия	DQ2/DQ7/DQ8	52.0
Болезнь Крона	DR1, DR4, DR7	2.0-7.0
Смешанное заболевание соединительной ткани	DR4	3
Первичный билиарный цирроз (ПБЦ)	DR3, DRB1*0803 (DR8)	3-6.8
Дробьевидная хориоретинопатия или хориоретинопатия Бирдшота	A29	224
Первичный склерозирующий холангит (ПСХ)	DR3, DR8	4.5-15
Герпетиформный дерматит Дюринга	DR3/DR7	17.3
Дерматомиозит	DR3/DR52	5
Сахарный диабет 1-го типа	DQ2/DQ3 подтипы DRB1*0405 (DR4)DQ*0602 (DQ6)DQB1*0602 (DQ6)	> 50 Защитный
Селективный дефицит иммуноглобулина А (IgА)	DR3	17.0
Мембранозный гломерулонефрит	DR3	12.0
Гранулематоз Ве́генера	DR9	6.7
Идиопатический гемохроматоз	A3/B7/B14	90.0
Аутоиммунный хронический гепатит	DR3, DR4, DR8, DR52	4.7
Хронический вирусный гепатит В	B35	158.0
Здоровые носители» HBsAg	B41	11.2
Врожденная гиперплазия надпочечников	B47 DR3	15.4 6.3
ВИЧ – Повышенная чувствительность к абакавиру	B * 5701	117
вич – медленно прогрессирующее заболевание	B27 B57	Protector Protector
Красный плоский лишай	DR1	11.8
Холелитиаз	A19	131
Системная красная волчанка (СКВ)	DR2/DR3	5.8
Лекарственная волчанка	DR4	5.6
Миастения гравис	DR3 DR5	3.9 3.6
Нарколепсия	DQB1*0602, DRB1*1501	130.0
Волчаночный нефрит	DR2/DQ1	14.0
IgA-нефропатия	DR4	5.5
Мембранозная нефропатия (МН)	DR3	3-12
Подострый склерозирующий панэнцефалит	A29	3.6
Пемфигус Вульгарис (обыкновенная пузырчатка)	DR3, DR4	14.4
Эритематозная пузырчатка (себорейная пузырчатка, синдром Сенира-Ашера)	DR1	7.3
Ревматоидный артрит	DR1/DR4 подтип	10.2
Ревматическая полимиалгия	DR3 DR4	2.3 5.7
Полимиозит	DR3/DR52
Бляшечный или вульгарный псориаз	B17, B37 Cw6	6.7 33.0
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура	DR2	9.2
Синдром Рейтера	B27	37.0
Диабетическая ретинопатия	B8	4.0
Саркоидоз	B7/B8DR2, DR3, DR5	8.5
Саркома Капоши	DR5	5.3
Шизофрения	A9/B27 A2/A11	11.9 9.8
Склеродермия (PSS)	DR3 DR5	16.7 10,0 10.0
Рассеянный склероз	DR2/DQ6 подтипы	4.1
Андрогенитальный синдром-поздняя форма начала	B14	48.5
Андрогенитальный синдром с сольтеряющей формой	B47	51.0
Антифосфолипидный синдром	DR4, DR7	5.1
Синдром астмы вызванный анальгетиками	A1/B8/DR3	28.9
Лимитированная склеродермия(CREST синдром)	DR5	8.1
Синдром Гудпасчера	DR2	15.9
Синдром Шегрена	DR2/DR3	9.7
Рецидивирующий афтозный стоматит	B7	6.0
Аутоиммунный тиреоидит(Тиреоидит Хашимото, боезнь Хашимото)	DR3, DR5	3.2
Подострый тиреоидит (ПТ) (тиреоидит де Кервена, гигантоклеточный тиреоидит, гранулематозный тиреоидит)	B35	13.7
Послеродовой тиреоидит	DR4/DR5	8.0
Неонатальная трансиммунная (аутоимунная) тромбоцитопения	DR3	9.2
Задний острый увеит	B27	10-50

Подготовка пациента-специальная подготовка не требуется – в форме отправки будет указано предполагаемое состояние, для которого требуется тестирование HLA7.

Собранный образец-венозная кровь 7.

Контейнер для сбора-vacutainer, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта7.

Собранное количество-насколько позволяет вакуум7.

Причины отторжения образца-использование гепарина в качестве антикоагулянта; коагулированные или гемолизированные образцы; охлажденные или замороженные образцы7.

Стабильность образца - 7 дней при 2-8ºC7.

Метод – метод-реакция цепной полимеризации (ПЦР) с обнаружением электрофорезом в агарозном геле 7.

Интерпретация результатов

Положительный результат на антиген HLA, связанный с определенным состоянием, показывает генетическую предрасположенность. Это приводит к относительному риску заболеть носителем по сравнению с „нормальным” населением (см. таблицу). В случае подозрения на конкретное состояние выделение антигена HLA является диагностическим критерием7..

 

Библиография

1. E. Albert Reece, Donal R.Coustan, Steven G.Gabe. Diabetes in Women, ed.3, 2004, 61-62.

2. H. Davis, Richard A. McPherson. Human Leukocyte Antigen: The Major Histocompatibility Complex of Man. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 8, 876-886.

3. HLA Nomenclature. IMGT/HLA database. www.ebi.ac.uk/imgt/hla/nomenclature/index.html. Ref Type: Internet Communication.

4. HLA Nomenclature Changes Effective April 1, 2010. www.ashi-hla.org. Ref Type: Internet Communication.

5. Jacob Sten Petersen. Antigen-based Prediction and Prevention of Type 1 Diabetes. In Danish Medical Bulletin nr.4/2006 418-437.

6. Julio C. Delgado, Edmond J. Yunis. The Major Histocompatibility Complex and Disease. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 8, 894-902.

7. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

8. Robert J. Winchester. The Major Histocompatibility Complex. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 79-89.

9. V. Radha, K.S.Vimaleswaran, R.Deepa, V. Mohan. The genetics of diabetes mellitus. In Indian J Med Res 117/2003 225-238.