Вирус гепатита В – генотипирование

Общая информация и рекомендации по генотипированию HBV

Вирус гепатита В, ДНК-вирус, является членом семейства Hepadnaviridae, которое реплицируется путем обратной транскрипции прегеномной РНК, инкапсулированной с помощью вирусной полимеразы. Полимераза не проявляет способности” исправлять ошибки чтения", возникающие при транскрипции, поэтому гетерогенность последовательностей является характеристикой HBV.

Анализ последовательностей ДНК вирусного генома привел к идентификации 4 различных генов, называемых C, S, P и X, которые кодируют aghbc/HBe, AgHBs, полимеразу и белки HBx соответственно. Экспрессия этих генов регулируется 4 промоторами (S1p, S2p, Cp и Xp) и 2 энхансерами (enhancer I, II)1.

Филогенетический анализ привел к классификации HBV на 9 генотипов (называемых A-I), которые отличаются друг от друга на >7.5% на уровне нуклеотидных последовательностей всего генома, с упоминанием, что все еще может существовать генотип J, который, однако, был выделен от одного человека. Кроме того, в генотипах A-D, F, H и I было описано не менее 35 субгенотипов, которые отличаются друг от друга на 4-8% 2.

9 генотипов демонстрируют отчетливое географическое распределение. Генотип A распространен в Северо-Западной Европе, Северной Америке и Африке, генотипы B и C преобладают в Азии, генотип D имеет повсеместное распространение, но преобладает в средиземноморской зоне. Генотип E встречается в Африке, генотип F в аборигенных популяциях Южной Америки, а генотип H ограничен индейскими популяциями в Центральной Америке. Генотип G может вызывать хроническую инфекцию только в присутствии других генотипов, особенно генотипа A, и передается преимущественно через гомосексуальный контакт; он был идентифицирован по предметам в США, Мексике, Германии, Италии, Великобритании, Франции. Генотип I был описан у людей в Лаосе, Вьетнаме и Индии, связанных с перинатальной передачей. "Генотип J" был выделен у японского мужчины с гепатоцеллюлярной карциномой, который долгое время жил на Борнео 2

На вариацию и эволюцию HBV влияла межгенотипическая рекомбинация. Только генотип H не показывает рекомбинации, в то время как 97% генотипа B состоит из рекомбинантных вирусных штаммов 2.

Первым свидетельством того, что биологические свойства HBV различаются в зависимости от генотипа, было наблюдение, что мутация, вводящая преждевременный стоп-кодон в положение 1896 пре-основной области, часто встречается в регионах, где преобладает генотип D, и отсутствует в регионах с генотипом A. впоследствии было обнаружено, что гетерогенность в общем распределении генотипов HBV ответственна не только за различия в распространенности мутаций HBV в разных популяциях, но и за различия в клинической эволюции инфекции HBV и реакции на лечение противовирусными препаратами 3.

Связь между мутациями HBV и генотипами

Предкорпусная область генома HBV кодирует предкорпусный слитый белок, который посттрансляционно модифицируется с образованием AgHBe. Точная функция AgHBe неизвестна; считается, что он играет роль в иммуномодуляции и может изменить реакцию хозяина на основной белок. Таким образом, развитие мутации Stop Codon 1896 G>A, которая предотвращает экспрессию AgHBe, будет представлять собой механизм уклонения от иммунитета. Появление мутации 1896 ограничено вторичной структурой белка є, связанной с сигналом инкапсуляции, и кодируется той же областью генома HBV, что и AgHBe. Дестабилизация этой структуры путем дислокации пары оснований C-G между кодонами 1858 и 1896 годов (что приведет к мутации G>A в положении 1896 года) нанесет ущерб репликации. По этой причине развитие мутации 1896 зависит от наличия или отсутствия основания C или T в положении 1858 и показывает географическое изменение, которое может коррелировать с распределением генотипов (см. рисунок). Генотипы B, D и E показывают T1858, тогда как генотипы A и H имеют С.

Генотипы C и F могут иметь T1858 или C1858 : штаммы, имеющие Центральноамериканский генотип F , а штаммы, имеющие генотип C из Японии, характеризуются исключительно T1858, тогда как C1858 ограничен носителями генотипа C из Юго-Восточной Азии. В заключение, мутация 1896 чаще встречается у пациентов с положительными анти-HBe, инфицированных генотипом D и E, редко в связи с генотипом A и только у меньшинства пациентов с генотипами C и F3;4.

Рис. 18.3.7.1 конкретная структура последовательности инкапсуляции предварительно основной области HBV

(Адаптация по Chan HL et al. J Clin Microbiol. 2006)

Мутации, возникающие в области промотора ядра (BCP = Basic Core-Promoter), трансверсии A>T в положении 1762 вместе с переходом G>A в положении 1764 (T1762A1764), были первоначально описаны у японских пациентов. Их присутствие предшествует сероконверсии AgHBe в случае генотипа A, но не в случае генотипа D; они также связаны с низкими уровнями мРНК precore и экспрессии AgHBe. Была обнаружена статистически значимая связь этих мутаций с более тяжелым поражением печени и возрастом >35 лет.3;5. Генотип C имеет более высокую распространенность мутаций BCP по сравнению с генотипом B. Согласно исследованиям в азиатской популяции варианты BCP представляют собой независимый фактор риска развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы 5.

Были описаны различные мутации в области pre-S, от точечных мутаций, делеций и небольших вставок до очень больших делеций. В двух независимых исследованиях было обнаружено, что варианты с делециями pre-S чаще связаны с генотипом B, чем с C. напротив, другое исследование, хотя и показало, что мутации pre-S чаще встречаются у носителей генотипа B и C по сравнению с остальными генотипами, не указывает на статистически значимую разницу между генотипами B и C. Эти варианты чаще обнаруживаются у пациентов с тяжелым заболеванием печени (цирроз или гепатоцеллюлярная карцинома), поскольку они могут влиять на клиренс вируса и способствовать хроничности инфекции3.

Также описаны варианты HBV, возникающие в результате инкапсуляции и обратной транскрипции прегеномной РНК, подвергшейся сплайсингу – - "сплайсинг вариантов сплайсинга". Исследования показали, что нет никакой разницы между доминантными вариантами сплайсинга, продуцируемыми генотипами D, C и E, в то время как незначительные варианты сплайсинга, синтезированные изолятами, принадлежащими к различным генотипам, различны. Сплайсинг может способствовать патогенности и / или стойкости вируса3.

Связь между прогрессированием инфекции HBV и генотипами

В целом, частота хронизации выше при острой инфекции HBV генотипами A/D по сравнению с генотипами B/C5.

Пациенты, инфицированные генотипами A, B, D и F, чаще и раньше демонстрируют сероконверсию AgHBe по сравнению с пациентами, инфицированными генотипом C, независимо от этнической принадлежности. Генотип E был связан с более высоким уровнем позитивности AgHBe и более высокими вирусными нагрузками по сравнению с генотипом D2.

Поскольку на прогрессирование заболевания влияют несколько факторов, таких как возраст заражения инфекцией, путь передачи, иммунная компетентность хозяина и факторы окружающей среды (употребление алкоголя, перегрузка железом и воздействие афлатоксина), интерпретация роли, выполняемой генотипами, должна быть выполнена с большим вниманием3.

Большинство исследований влияния генотипов HBV на прогрессирование заболевания проводилось в Юго-Восточной Азии, где HBV является гиперендемическим и преобладают генотипы B и C.

Пациенты, инфицированные генотипом B, имеют более высокую вероятность наличия устойчивой биохимической ремиссии после спонтанной сероконверсии AgHBe, чем пациенты, инфицированные генотипом C. генотип C более распространен у пациентов с фиброзом или циррозом печени и связан с более тяжелым гистологическим поражением печени по сравнению с генотипами B или D. пациенты, инфицированные генотипом C, имеют более высокие показатели некровоспалительной активности и фиброза, а также более высокие уровни сывороточных трансаминаз по сравнению с генотипами B, A или Д. Генотип C также был связан с более высоким риском развития гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с генотипом B3.

На Западе исследования влияния генотипов HBV на прогрессирование заболевания менее многочисленны. В Европе было обнаружено, что долгосрочная эволюция инфекции HBV различна в зависимости от генотипов. Генотип а был более распространен у пациентов с хроническим гепатитом AgHBe, в то время как генотип D преобладал у пациентов с анти-HBe-положительным. Пациенты с генотипом D, независимо от того, были ли они положительными или отрицательными AgHBe, показали более высокие значения вирусной нагрузки по сравнению с генотипами A, B и C. Прогноз хронического гепатита B будет лучше у пациентов, инфицированных генотипом a, по сравнению с пациентами с генотипом D или F, поскольку он демонстрирует более высокую скорость устойчивой биохимической ремиссии и снижения виремии. Генотип D был связан с тяжелым рецидивирующим заболеванием после трансплантации 3.

Румыния входит в число стран с высокой распространенностью носителей AgHBs (16%). В недавно опубликованном исследовании с участием 130 пациентов с различным спектром инфекции HBV было обнаружено, что генотип D имел самую высокую распространенность (66%) и был связан с активной инфекцией и прогрессированием до гепатоцеллюлярной карциномы. Генотип A коррелировал со статусом неактивного носителя AgHBs, тогда как хроническая длительная инфекция в большинстве случаев была связана со смесью генотипов A и D6.

Связь между ответом на противовирусное лечение и генотипам

В исследовании немецких пациентов было обнаружено, что у инфицированных генотипом a уровень сероконверсии AgHBe выше при лечении интерфероном Альфа-пегилатом (PegINFa), чем у пациентов с генотипом D. В исследовании, проведенном на Тайване, скорость исчезновения AgHBe при Пегинфе была значительно выше у пациентов с генотипом B по сравнению с генотипом C.

Что касается ответа на Ламивудин, генотип B связан с лучшим вирусологическим ответом по сравнению с генотипом C у тайваньских пациентов. Однако оба генотипа имеют одинаковый риск развития устойчивости к ламивудину после года терапии. Мутации, связанные с устойчивостью к Ламивудину, развиваются медленнее в случае генотипа D.

В большом исследовании, проведенном в Японии, частота возникновения резистентности к Ламивудину не зависела от генотипов A, B и C. Это исследование также показало, что влияние положительности AgHBe на устойчивость к Ламивудину различается в зависимости от генотипов и что риск развития тяжелого гепатита выше у пациентов, инфицированных генотипом C3.

Согласно руководству Европейской ассоциации по изучению печени (EASL) за 2017 год, информация о генотипах HBV может быть полезна при установлении правил прекращения лечения Пегинфой:

• у пациентов с хроническим положительным гепатитом AgHBe уровни AgHBs > 20000 МЕ/мл в случае генотипов B и C или отсутствие снижения уровня AgHBs в случае генотипов A и D после 12 недель лечения связаны с очень низкой вероятностью сероконверсии AgHBe и могут использоваться в качестве правила прекращения терапии Пегинфа.
• у пациентов с хроническим положительным гепатитом AgHBe и генотипом A-D уровни AgHBs > 20000 МЕ/мл после 24 недель лечения связаны с очень низкой вероятностью сероконверсии AgHBe и могут использоваться в качестве правила прекращения терапии Пегинфа.
• у пациентов с хроническим отрицательным гепатитом AgHBe и генотипом D отсутствие снижения уровня AgHBs и снижение виремии B < 2 log10 МЕ/мл после 12 недель лечения связано с очень низкой вероятностью ответа на лечение и может использоваться в качестве правила прекращения терапии PegINFa7.

Подготовка пациента-специальная подготовка не требуется8.

Собранный образец-венозная кровь 8.

Контейнер для сбора-vacutainer, содержащий ЭДТА в качестве антикоагулянта8.

Необходимая обработка после сбора-отделяем плазму центрифугом8.

Объем образца-минимум 5 мл плазмы 8.

Стабильность образца-отдельная плазма стабильна 1 месяц при-20ºc8.

Метод-цепная полимеризационная реакция с последующей обратной гибридизацией со специфическими олигонуклеотидными зондами на stripuri8.

Границы и помехи

Выполнение генотипирования HBV не рекомендуется для скрининга или подтверждения инфекции HBV. Тест возможен только в случае наличия виремии B > 1000 МЕ/мл8.