Anticorpi anti-citoplasma neutrofile (ANCA) – imunofluorescenta

Informaţii generale

Anticorpii ANCA au fost descrişi pentru prima dată în 1982 la pacienţi cu glomerulonefrită de natură autoimună.

ANCA sunt anticorpi (de tip IgG, mai rar IgA şi IgM) îndreptaţi în principal împotriva antigenelor din citoplasmă granulocitelor neutrofile (ţintele moleculare fiind enzimele din granulaţiile primare sau azurofile ale granulocitelor neutrofile) şi monocitelor^1;4;5.

Utilizând ca substrat neutrofile fixate cu etanol, la examenul prin imunofluorescenţă indirectă au fost descrise 3 pattern-uri principale:

• citoplasmatic (c-ANCA), caracterizat prin fluorescenţa granulară citoplasmatică difuză, cu accentuare centrală interlobulară; antigenul este reprezentat de proteinaza3 (PR3), un component atat al granulaţiilor azurofile din celulele mieloide, cât şi al lizozomilor monocitari;
• perinuclear (p-ANCA), caracterizat prin fluorescenţa perinucleară (inelară) omogenă, fără fluorescenţă citoplasmatică; principalul antigen este mieloperoxidaza (MPO), o proteină a granulaţiilor neutrofile implicată în procese metabolice cum ar fi generarea de radicali de oxigen. Acest pattern apare datorită migrării antigenelor încărcate pozitiv (cationice) în timpul fixării cu etanol spre membrana nucleară care este încărcată negativ. Atunci când în loc de etanol se utilizează formalina pentru fixarea neutrofilelor, antigenul ţintă este imobilizat şi se obţine o fluorescenţă citoplasmatică.
• atipic ANCA (x-ANCA), caracterizat prin fluorescenţa perinucleară neomogenă; antigenele implicate sunt catepsina G, elastaza, lactoferina, catalaza, enolaza, lizozimul, BPI (proteina bacteridă care creşte permeabilitatea) sau alte antigene necunoscute. Spre deosebire de aspectul p-ANCA tipic, atunci când în loc de etanol se utilizează formalina pentru fixarea neutrofilelor nu se obţine fluorescenţa⁴.

Au mai fost descrişi anticorpii GS-ANA (granulocyte-specific ANA = anticorpi anti-nucleari specifici granulocitelor) care produc o fluorescenţă nucleară sau perinucleară pe substratul fixat cu etanol, dar negativă pe substrat Hep-2 şi care apar la 20% dintre pacienţii cu artrită reumatoidă (prezenţa lor ar putea fi determinată de ingestia complexelor imune de către neutrofile, antigenul ţintă nefiind încă identificat)¹.

Anticorpii ANCA se depistează predominant la pacienţii cu vasculită sistemică pauciimună, caracterizată histologic prin necroza fibrinoidă prezentă în pereţii venulelor, capilarelor şi arteriolelor. Spre deosebire de vasculita mediată prin complexe imune, în vasculitele asociate cu ANCA lipsesc depozitele de complexe imune din peretele vascular, fiind prezente în schimb, mai ales în stadiile precoce de boală, polimorfonucleare. Afectarea endoteliului vascular, indusă de neutrofile, deţine de asemenea un rol important în patogenia vasculitelor pauciimune.

Anticorpii c-ANCA se asociază în mod specific cu boala Wegener. In cazul unei boli active cu vasculită sistemică, glomerulonefrita necrotizantă şi inflamaţie de tip granulomatos a tractului respirator, sensibilitatea clinică a c-ANCA este de 85-90%.

În lipsa afectării renale sensibilitatea clinică este de numai 75%. Titrul anticorpilor c-ANCA se corelează cu gradul de activitate a bolii; după terapia imunosupresoare titrul anticorpilor scade foarte mult sau se obţine un rezultat negativ. c-ANCA mai pot apărea în poliangeita microscopică şi in sindromul Churg-Strauss, însă cu o prevalenţă redusă (45% şi, respectiv, 10%).

Anticorpii p-ANCA apar tipic în glomerulonefrita rapid progresivă idiopatică, sindromul Churg-Strauss, poliangeita microscopică şi panarterita nodoasă clasică (sensibilitate clinică de 65%, 60%, 45% şi respectiv 15%). Peste 90% din cazurile confirmate bioptic de glomerulonefrita necrotizantă pauciimună sunt p-ANCA pozitive. p-ANCA se mai depistează sporadic la unii pacienţi cu o anumită formă de sclerodermie, caracterizată prin hemoragie pulmonară şi insuficienţă renală normotensivă^3;5.

Anticorpii x-ANCA se asociază cu hepatitele autoimune, colangita sclerozantă primitivă, bolile inflamatorii intestinale (colita ulceroasă şi boala Crohn), sindromul Felty^1;5. Majoritatea pacienţilor adulţi cu colită ulceroasă prezintă anticorpi p-ANCA ce sunt sensibili la DNA-aza, proprietate ce poate ajuta în diagnosticul diferenţial al anticorpilor p-ANCA din bolile inflamatorii de cei din hepatita autoimună şi colangita sclerozantă.

Ghidurile internaţionale (International Consensus Statement) recomandă testarea şi raportarea ANCA utilizând metoda imunofluorescenţei indirecte în combinaţie cu metoda imunoenzimatică care detectează specificitaţile ANCA pentru MPO şi PR3. Deseori, sub presiunea optimizării costurilor, screening-ul este realizat prin imunofluorescenţă şi este urmat de metoda imunoenzimatică numai dacă rezultatul este pozitiv. O înaltă sensibilitate diagnostică pentru anticorpii ANCA este dobândită atunci când se utilizează simultan, din start, imunofluorescenţa şi metoda imunoenzimatică. Acest lucru poate fi posibil utilizând o combinaţie de neutrofile fixate cu etanol, neutrofile fixate cu formalină, substrat Hep-2, ficat de primate şi spoturi tip microdrops cu amprente antigenice unice (MPO si PR3) în acelaşi câmp de incubaţie. Astfel este posibilă prediferenţierea autoanticorpilor prin compararea pattern-urilor fluorescente, iar acestea se pot confirma reciproc. Prin combinarea substraturilor convenţionale cu amprentele antigenice definite anti-MPO şi anti-PR3, rezultatul testului de screening poate fi confirmat direct.

Neutrofilele fixate cu etanol reprezintă substratul standard pentru anticorpii ANCA. Formalina previne migrarea antigenelor neutrofile din citoplasmă către membrana nucleară şi distruge antigenele nucleare. Pe substratul fixat cu etanol, antigenele neutrofile citoplasmatice sunt încărcate pozitiv şi migrează spre membrana nucleară încărcată negativ, rezultând un pattern p-ANCA. Dacă neutrofilele sunt tratate cu formalină, se realizează legături covalente între proteine, migrarea este oprită şi antigenele rămân în citoplasmă. Astfel, probele având un aspect p-ANCA pe substratul fixat cu etanol  prezintă un aspect c-ANCA pe substratul fixat cu formalină, în timp ce probele ANA pozitive devin negative sau îşi reduc intensitatea când sunt trecute pe substratul fixat cu formalină. Frecvent, probele pacienţilor sunt pozitive atât pentru anticorpii ANCA, cât şi pentru anticorpii ANA. Anticorpii ANA  pot mima pattern-ul p-ANCA pe substratul fixat pe etanol, de aceea este necesar să se facă distincţia între pattern-urile c-ANCA şi p-ANCA adevarate de cele non-ANCA (fals-pozitive)².

Recomandări pentru determinarea anticorpilor ANCA (condiţii clinice asociate)

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)². 

Specimen recoltat – sânge venos².

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator².

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare².

Volum probă – minim 2 mL ser².

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian².

Stabilitate probă – serul separat este stabil 7 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20°C³.

Metodă – imunofluorescenţă indirectă².

Valori de referinţă, comunicarea şi interpretarea rezultatelor

<1/10: Negativ

Limite şi interferenţe 

Bibliografie