Chlamydia trachomatis ADN + N. gonorrhoeae ADN – urina (barbati)

Chlamydia este o bacterie Gram negativă de dimensiuni foarte mici, obligatoriu intracelulară datorită faptului că nu îşi poate sintetiza ATP-ul, fiind cultivabilă doar în celulele vii eucariote (ouă embrionate sau culturi celulare).

Clasificări recente împart Chlamydiile în 4 familii, dintre care cea mai importantă în patologia umană este familia Chlamydiaceae, care conţine două genuri:

• genul Chlamydia – cel mai important reprezentant fiind C. trachomatis;
• genul Chlamydophila – C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus, etc.

Chlamydia trachomatis este întâlnită aproape în exclusivitate la om. Sunt descrise 15 serovaruri implicate în diverse infecţii^1;2.

Infecţia cu Chlamydia trachomatis este cea mai frecventă boală cu transmitere sexuală de cauză bacteriană. Grupa de vârstă cea mai afectată este 15-25 ani, prevalenţa infecţiei fiind între 2 şi 25%.

Perioada de incubaţie a bolii variază în general între 1 şi 3 săptămâni, ajungând în unele cazuri la 6 săptămâni. O mare parte a infecţiilor evoluează asimptomatic: 75% din infecţiile la femei şi 50% din infecţiile la bărbaţi. În cazurile simptomatice la bărbat pot apărea uretrită şi proctită în faza acută; în lipsa tratamentului se poate instala cronicizarea cu epididimită, prostatită şi artrită reactivă. Simptomele clinice la femeie constau în uretrită, cervicită şi bartolinită care se pot complica cu: endometrită, salpingită, pelviperitonită, perihepatită precum şi artrită reactivă.

Caracterul asimptomatic al multor infecţii cu Chlamydia trachomatis este responsabil de subdiagnosticarea acestora, cu importante consecinţe mai ales la femei datorită corelaţiei dovedite între infecţia netratată şi complicaţii cum ar fi sarcina ectopică şi infertilitatea.

Fiind o boală cu transmitere sexuală evaluarea partenerilor este obligatorie pentru a preveni reinfecţiile.

Ca şi în cazul altor boli cu transmitere sexuală infecţia cu Chlamydia trachomatis poate facilita transmiterea infecţiei HIV. În plus, nou-născuţii se pot infecta la trecerea prin canalul cervical şi pot dezvolta conjunctivită, faringită şi pneumonie^3;4;5.

Diagnosticul infecţiilor cu Chlamydia trachomatis include izolarea agentului patogen în culturi celulare, depistarea antigenului prin metode imunologice şi determinarea ADN-ului prin tehnici moleculare. Deoarece culturile celulare sunt laborioase şi necesită timp nu se folosesc de rutină fiind apanajul unor laboratoare speciale^3;5

Numeroasele studii au indicat că tehnicile de amplificare ADN detectează cu aproximativ 15% mai multe înfecţii comparativ cu celelalte metode care nu se bazează pe culturi celulare, cu o specificitate >99%. În plus, testul ADN poate utiliza probe care nu sunt compatibile cu metodele bazate pe culturi cum ar fi cele de urină la bărbaţi⁶.

Pe lângă ADN-ul cromozomial C. trachomatis conţine o plasmidă criptică care este comună tuturor serovarurilor. Din acest motiv, testele moleculare au drept ţintă secvenţe nucleotidice de la nivelul acestei plasmide. În 2006 a fost descrisă pentru prima dată varianta suedeză de Chlamydia trachomatis ce prezintă prezintă o deleţie de 377 bp în interiorul plasmidei ADN şi care nu este detectată de unele teste comerciale⁵.

Neisseria gonorrhoeae, un diplococ Gram negativ, este agentul etiologic al gonoreei, una din cele mai frecvente boli cu transmitere sexuală.

La bărbaţi infecţia este în cele mai multe cazuri simptomatică, fiind asociată cu uretrită anterioară însoţită de secreţie purulentă. Perioada de incubaţie este de 1-10 zile. La femei principala localizare a infecţiei este endocervixul. Se descrie o prevalenţă crescută a coinfecţiilor cu Chlamydia trachomatis şi Trichomonas vaginalis precum şi asocierea cu vaginoza bacteriană. Multe dintre femei rămân asimptomatice şi din acest motiv nu se prezintă la medic. Atunci când apar manifestările clinice acestea sunt reprezentate de secreţii vaginale modificate, disurie, dispareunie, sângerări intermenstruale. Alte posibile localizări ale infecţiei gonococice sunt rectul, faringele, conjunctiva; rareori se pot produce infecţii diseminate. Copiii născuţi din mame infectate pot prezenta conjunctivită.

În absenţa tratamentului antibiotic adecvat se pot dezvolta complicaţii acute sau tardive, cum ar fi: epididimită sau prostatită la bărbaţi; boală inflamatorie pelvină, perihepatită, infertilitate, sarcini ectopice la femei^3;4;5.

1. gonorrhoeae este un germene labil care nu supravieţuieşte în probele ce sunt recoltate în afara laboratorului. Din acest motiv, diagnosticul microbiologic bazat pe cultură are valoare scăzută în aceste cazuri.

Dezvoltarea tehnicilor de amplificare a acizilor nucleici a îmbunătăţit depistarea infecţiilor cu gonoc, aceste tehnici prezentând în mod evident o serie de avantaje în comparaţie cu metodele clasice de cultivare:

• deoarece este detectat ADN-ul bacterian nu este necesar ca microorganismul să fie viabil;
• prezintă o sensibilitate mai mare;
• la bărbaţi testul poate fi efectuat din urină, ceea ce creşte complianţa pacienţilor la investigaţie⁶.

Ca o concluzie la cele menţionate mai sus Chlamydia trachomatis (CT) şi Neisseria gonorrhoeae (GC) sunt agenţii patogeni cel mai frecvent implicaţi în bolilele cu transmitere sexuală de cauză bacteriană. Foarte important,  coinfecţia CT-GC este raportată în aproximativ 30% din cazuri (mai frecvent la femei) de unde şi necesitatea testării combinate a celor doi patogeni.

Diagnosticul precoce al infecţiilor constituie o provocare deoarece o mare parte din persoanele afectate nu prezintă simptome. În absenţa diagnosticului şi tratamentului pot conduce la infecţii diseminate la bărbaţi şi la boală inflamatorie pelvină la femei cu consecinţe tardive semnificative: infertilitate, sarcină ectopică, durere pelvină cronică^4;7.

În cazul ambelor infecţii este posibilă transmiterea perinatală cu dezvoltarea conjunctivitei la nou-născut. De asemenea, CT şi GC se asociază cu risc crescut de transmitere a infecţiei HIV⁷.

Una din cele mai bune metode de a preveni complicaţiile infecţiilor CT şi GC este screening-ul adolescenţilor şi adulţilor tineri precum şi a femeilor gravide. Dacă o persoană este diagnosticată cu una sau ambele infecţii toţi partenerii sexuali trebuie testaţi şi trataţi corespunzător⁴.

Ghidul CDC (Centers for Disease Control and Prevention) recomandă ca screening-ul să se efectueze cu teste de amplificare a acizilor nucleici cu sensibilitate şi specificitate înaltă, confirmând faptul că metodele moleculare constituie în prezent standardul de diagnostic al infecţiilor CT şi GC³.

În laboratorul nostru se utilizează o metodă real-time PCR complet automatizată a cărei performanţă a fost recent evaluată în câteva studii. Acestea au indicat faptul că testul are o sensibilitate şi specificitate foarte bune pentru detecţia calitativă a ADN-ului CT şi NG în probe urogenitale, dovedind în acelaşi timp şi o eficienţă înaltă:

• pentru CT: sensibilitate de 6-98%, specificitate de ≥99.6%;
• pentru GC: sensibilitate de 9-100%, specificitate de ≥99.8%^8;9.

Din punct de vedere tehnic testul are la bază amplificarea a două secvenţe ADN ţintă pentru fiecare din cei doi agenţi patogeni în scopul reducerii numărului de rezultate fals-negative şi fals-pozitive. Astfel,  în cazul CT sunt utilizaţi primeri şi sonde specifice pentru o secvenţă de aproximativ 206 nucleotide din plasmida criptică precum şi pentru o secvenţă de cca 182 nucleotide din cadrul ADN-ului cromozomial (gena ompA care codifică proteina majoră a membranei externe). Pentru NG se folosesc primeri şi sonde care ţintesc atât o secvenţă de aproximativ 190 nucleotide din regiunea repetitivă directă înalt conservată  denumită DR-9 cât şi o secvenţă de ~ 215 nucleotide identificată drept o variantă de secvenţă conservată din această regiune. În plus, este introdus în fiecare probă un control intern CT/NG reprezentat de o combinaţie de două plasmide ADN neinfecţioase care monitorizează toate etapele  reacţiei PCR.

În ceea ce priveşte performanţa analitică, testul este capabil să identifice alături de cele 14 serovaruri şi varianta suedeză de CT; în cazul NG nu există reacţii încrucişate cu bacteriile Neisseria cinerea, flava, lactamica, perflava, subflava raportate la alte teste moleculare^5;8.

Ca tip de probe sunt utilizate tamponul endocervical la femei şi urina primul jet la bărbaţi. Menţionăm că în cazul bărbaţilor testarea probelor de urină prezintă o sensibilitate şi specificitate foarte bune reprezentând o alternativă non-invazivă la analiza probelor uretrale¹⁰.

Recomandări pentru determinarea Chlamydia trachomatis ADN – diagnosticul infecţiilor acute urogenitale, screening-ul infecţiei la persoanele cu risc crescut; screening-ul gravidelor în primul trimestru de sarcină (pentru gravidele ≤ 25 ani cât şi pentru cele cu risc crescut de infecţii CT şi NG testarea va fi repetată şi în trimestrul III; în cazul gravidelor la care s-a obţinut un rezultat pozitiv în trimestrul I testarea va fi repetată după 3-6 luni)^3;6.

Specimen recoltat – se vor recolta probe provenite din tractul urogenital: tampon endocervical pentru femei şi urină primul jet pentru bărbaţi;

Recoltarea probei de urină

Înainte de recoltarea propriu-zisă pacientul nu trebuie să urineze timp de cel puţin 1 oră; apoi se recoltează într-un recipient de unică folosinţă prevăzut cu un capac etanş (de exemplu, paharul pentru urină din 24 ore furnizat de laborator)  aproximativ 10-20 mL din primul jet de urină.

În decurs de 24 ore de la recoltare proba de urină trebuie transferată în tubul de transport din fig.2. Până atunci proba va fi menţinută la 2-30ºC.

Transferul probei în tubul transport va fi efectuat la sediul laboratorului utilizând pipeta de plastic din kit. În cazul în care probele nu pot ajunge în laborator în decurs de 24 ore colaboratorii Synevo vor solicita tuburi de transport în vederea transferării probelor în locaţiile respective.

Pentru a se asigura un volum corect de urină nivelul lichidului trebuie să se situeze între cele două linii negre marcate cu săgeţi pe eticheta tubului. Tubul va fi închis etanş şi etichetat corespunzător. Pentru o bună omogenizare a urinei cu mediul stabilizator din tub se vor efectua 5 mişcări de inversiune a tubului⁵.

Fig. 2: Sistem de transfer al probelor de urină

Stabilitate probă – 3 luni la temperaturi de 2-30ºC pentru probele endocervicale şi pentru probele de urină stabilizate (transferate în tub)⁵.

Metodă – Real-time PCR; sunt folosite următoarele tipuri de controale: control intern CT/NG, control negativ şi control pozitiv³.

Valori de referinţă

Chlamydia trachomatis (CT) ADN nedetectabil.

Neisseria gonorrhoeae (NG) ADN nedetectabil

Un rezultat invalid indică o eroare de amplificare a acizilor nucleici fiind necesară retestarea probei sau în unele cazuri, repetarea recoltării⁵.

Limite şi interferenţe

Un rezultat nedetectabil nu exclude prezenţa unei infecţii deoarece rata de detecţie depinde de calitatea probei recoltate, numărul de microorganisme prezente în probă, stadiul infecţiei precum şi de tulpinile CT/NG infectante.

Prezenţa mucusului în probele endocervicale poate inhiba reacţia PCR. De asemenea prezenţa sângelui într-un procent mai mare de 5% (v/v) în probele endocervicale şi mai mare de 0.35% (v/v) în probele de urină transferate poate conduce la rezultate invalide sau fals-negative.

Valoarea predictivă a testului este influenţată de prevalenţa infecţiei într-o anumită populaţie sau grup. Astfel, în grupurile cu prevalenţă crescută a bolilor cu transmitere sexuală valoarea predictivă pozitivă este crescută. În schimb în grupurile cu prevalenţă scăzută a acestor categorii de infecţii rezultatele pozitive trebuie să fie atent interpretate în contextul clinic general al pacientului, luând în considerare şi posibilitatea existenţei unor rezultate fals pozitive.

Performanţa stabilită pentru probele de urină se bazează pe testarea primului jet de urină. Pentru alte tipuri de probe de urină performanţa nu a fost evaluată.

Testul nu detectează variantele de C. trachomatis lipsite de plasmide însă acestea sunt rar întâlnite în infecţiile genitale.

În general, testul nu se recomandă pentru aprecierea eficienţei tratamentului antibiotic deoarece acizii nucleici din aceşti patogeni pot persista cel puţin 3 săptămâni după încheierea terapiei. După această perioadă de timp retestarea este utilă în cazul gravidelor, atunci când se suspectează o lipsă de complianţă la tratament sau o reinfecţie şi în cazurile în care simptomatologia persistă.

Testul nu va fi folosit în practica medico-legală (în cazurile de abuz sexual), cultura celulară fiind singura metodă acceptată în aceste situaţii⁵.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Obligate Intracellular and Nonculturabile Bacterial Agents. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12^th ed., 2007, 510-524.
2. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Chlamydial, Rickettsial, and Mycoplasmal infections. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods– Sauders Elsevier 21-Ed 2007- pg 1002, 1003.
3. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines 2010,” MMWR Recomm Rep, 2013, vol. 59(RR12):1-116.
4. Bernard M. Karnath. Manifestations of Gonorrhea and Chlamydial In Hospital Physician May/June 2009. www.turner-white.com.
5. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.
6. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
7. Specialty Laboratories. Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae for symptomatic and asymptomatic patients. specialtylabs.com. Ref Type: Internet Communication.
8. Rebecca Rockett, Namraj Goire et al. Evaluation of the cobas 4800 CT/NG test for detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Sex Transm Infect 2010;86:470-
9. Barbara Van Der Pol,a,b Oliver Liesenfeld, et al. Performance of the cobas CT/NG Test Compared to the Aptima AC2 and Viper CTQ/GCQ Assays for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Journal of Clinical Microbiology, 2012, vol. 50, No.7, p. 2244-2249.
10. Taylor SN, Liesenfeld O, et al. Evaluation of the Roche Cobas CT/NG test for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male urine. In Sex Transm Dis. 2012, 39(7): 543-9.