Cofactorul pentru ristocetină

Informaţii generale

Factorul von Willebrand (FvW) este o glicoproteină de adeziune, cu multiple roluri în coagulare, care circulă în plasmă sub forma unui amestec heterogen de multimeri legaţi disulfidic. FvW este sintetizat în celulele endoteliale şi megakariocite sub forma unei pre-pro-molecule, conţinând un peptid semnal de 22 aminoacizi, un propeptid de 741 aminoacizi şi proteină matură de 2050 aminoacizi. FvW este neobişnuit de bogat în cisteină, implicată în formarea de legături disulfidice. Monomerii pro-FvW sunt asamblaţi la nivelul reticulului endoplasmic în dimeri prin legături disulfidice ale capetelor C-terminale, iar multimerizarea are loc în aparatul Golgi prin formarea de legături disulfidice ale capetelor N-terminale ale dimerilor adiacenţi, proces ce pare a fi catalizat de o activitate disulfid-izomerazică localizată în propeptidul FvW⁴. Clivarea propeptidului are loc după asamblarea multimerilor, în special intracelular, dar poate avea loc şi după secreţie. Multimerii de FvW variază în mărime, de la dimerii de 600 000D la multimerii foarte mari de 20 milioane D. FvW este stocat  în α-granulele plachetare şi în corpusculii Weibel-Palade din celulele endoteliale, acestea fiind formele cele mai mari şi mai potente biologic. Rezervele endoteliale de FvW pot fi eliberate terapeutic prin administrarea de desmopreşină.

Timpul de înjumătăţire al FvW plasmatic este de ~8-12 ore. Aproximativ 15% din FvW circulant este localizat în compartimentul plachetar, acesta fiind derivat în întregime din sinteza intramedulară, dar ambele pool-uri de FvW sunt necesare pentru hemostază. Celulele endoteliale secretă multimeri mai mari decât cei care circulă în plasmă; aceştia sunt degradaţi de către o metaloprotează specifică, ADAMTS13, rezultând reducerea în mărime a celor mai mari multimeri. Scăderea activităţii ADAMTS13, congenitală sau prin inhibitori dobândiţi, joacă un rol central în patofiziologia purpurei trombotice trombocitopenice^3;4.

FvW are situsuri de legare pentru FVIII, heparină, colagen, glicoproteinele plachetare GPIb şi GPIIb-IIIa, deţinând multiple funcţii în hemostază. FvW stabilizează FVIII protejându-l  faţă de inactivarea de către PC activată, prelungindu-i astfel timpul de înjumătăţire în circulaţie şi localizându-l eficient la locul injuriei vasculare^1;2;4. Fiecare monomer de FvW are un situs de legare pentru FVIII, totuşi in vivo numai 1-2% din monomeri sunt ocupaţi de FVIII, astfel explicându-se faptul că prezenţa multimerilor foarte mari nu este esenţială pentru funcţia de carrier a FVIII. In orice caz, o modificare în nivelul plasmatic al FvW se asociază cu modificări concordante ale concentraţiei plasmatice de FVIII².

FvW este o proteină structurală şi parte a matricei subendoteliale. De asemenea joacă un rol important în ataşarea plachetelor la suprafeţele subendoteliale, în mod particular la forţe de forfecare moderate-mari (funcţie explorată parţial in vivo prin măsurarea timpului de sângerare), acţionează ca punte între plachete şi promovează agregarea plachetară. Iniţial are loc ancorarea plachetelor la locul injuriei vasculare prin interacţiunea FvW cu GPIb, urmată de activarea plachetară şi expunerea GPIIb-IIIa, care leagă fibrinogenul, FvW şi alţi liganzi^1;4. Ambele activităţi de legare ale FvW sunt maxime la multimerii cu greutate moleculară mare. Interacţiunea dintre GPIb şi FvW poate fi explorată in vitro prin adăugarea antibioticului ristocetină².

Nomenclatura recomandată de Societatea Internaţională de Hemostază şi Tromboză pentru complexul FVIII-FvW este²:

Anomaliile funcţiei FvW determină boala von Willebrand (vWD), cea mai frecventă boală hemoragică moştenită, cu o prevalenţă de aproximativ 1% în populaţia generală, însă cu o prevalenţă a bolii semnificative clinic de 1:1000⁴. Afecţiunea este caracterizată prin hemoragii cutaneo-mucoase, transmitere autosomal dominantă şi prelungirea timpului de sângerare. Boala nu este omogenă, pe de o parte datorită funcţiilor fiziologice multiple jucate de FvW, iar pe de altă parte prin demonstrarea de modele genetice diferite. Aproximativ 60% din variaţiile nivelului FvW plasmatic sunt atribuite unor factori genetici. Astfel, indivizii cu grup sanguin 0 au niveluri de FvW în medie cu 30% mai mici decât cei cu celelalte grupe sanguine. In plus, nivelul de FvW este sub control hormonal; de asemenea este influenţat şi de alţi factori care complică expresia bolii. Variaţii de până la 20% au fost raportate cu ciclul menstrual, nivelurile cele mai scăzute fiind înregistrate în faza foliculară precoce. De asemenea nivelul creşte cu ~15% la fiecare decadă de înaintare în vârstă³. Clasificarea actuală a vWD identifică două categorii majore^2;3;4:

• Deficienţe cantitative ale FvW:
  • Tipul 1, varianta cea mai comună (70-80% din cazurile simptomatice de vWD), caracterizată prin deficienţa parţială a FvW, însoţită de reducerea concordantă a activităţii FVIII şi activităţii de cofactor la ristocetină, în general între 20 şi 50% din normal, în asociere cu o structură normală a multimerilor.
  • Tipul 3 se asociază cu deficienţe severe şi nivele foarte scăzute sau nedetectabile de FvW. Este o formă rară, cu transmitere autosomal recesivă şi caracterizată prin diateză hemoragică severă.
• Anomalii calitative ale FvW (tipul 2, reprezentând 20-30% din cazuri), cu 4 subtipuri reflectând mecanisme patofiziologice diferite:
  • Tipul 2A se caracterizează  prin absenţa multimerilor de greutate moleculară mare şi intermediară din plasmă, rezultând în alterarea interacţiunii FvW cu plachetele şi se asociază cu nivele ale activităţii cofactorului la ristocetină disproporţionat de scăzute comparativ cu antigenul FvW.
  • Tipul 2B  se caracterizează prin afinitate crescută a FvW pentru GPIb plachetară, sângerarea la aceşti pacienţi rezultând paradoxal ca urmare a clearance-ului multimerilor cu greutate moleculara mare şi plachetelor din circulaţie, asociind trombocitopenie.
  • In tipul 2M interacţiunea FvW cu GPIb este deficitară rezultând din defecte ale domeniului FvW care leagă GPIb, cu scăderea funcţiei plachetar-dependente, în prezenţa de multimeri normali la electroforeza pe gel.
  • In tipul 2N (Normandy) afinitatea scăzută a FvW pentru FVIII determină niveluri plasmatice scăzute ale FVIII. Acest tip este suspectat în prezenţa unei reduceri marcate a nivelului FVIII în comparaţie cu FvW (pseudohemofilia).

Au fost raportate şi alte subtipuri, incluzând tipul plachetar (pseudo-vWD) care rezultă din mutaţii la nivelul GPIb plachetare. De asemenea există forme dobândite foarte rare de vWD asociate cu prezenţa de autoanticorpi, în asociere cu boli autoimune, proliferări clonale, hipotiroidism^4;6;7.

vWD se manifestă ca un defect hemostatic multifaţetat, deficienţa FVIII şi hemostaza primară anormală contribuind la tendinţa hemoragică şi conducând la anomalii de laborator caracteristice şi distincte³. Expresia  clinică este în general uşoară în tipul 1, cu creşterea severităţii în tipul 2 şi tipul 3. Mulţi din pacienţii cu tipul 1 de vWD pot fi asimptomatici. In general severitatea sângerării se corelează cu gradul reducerii activităţii FVIII, dar nu cu gradul prelungirii timpului de sângerare sau cu tipul grupului sanguin². In formele uşoare de vWD tabloul clinic este dominat de sângerările cutaneo-mucoase (epistaxis, echimoze, sângerări gingivale, menometroragii), iar în formele cele mai severe, în care FVIII este scăzut, pot apărea hemartroze şi hematoame intramusculare, hemoragiile posttraumatice şi postchirurgicale, în primul rand după extracţii dentare, constituind riscul principal, ca şi în hemofilia uşoară³. vWD poate fi înalt prevalenţa la pacientele cu menoragie izolată². In tipul 1 simptomele pot scădea în severitate în timpul sarcinii, terapiei estrogenice sau cu înaintarea în varstă. Pe de altă parte, riscul de sângerare la femeile cu vWD este mare postpartum când nivelul de FvW scade brusc de la nivelele crescute dezvoltate în timpul sarcinii³.

Recomandări pentru efectuarea testelor – diagnosticul deficitului/anormalităţii FvW, subtiparea vWD şi diferenţierea de hemofilia A (împreună cu determinarea activităţii FVIII); monitorizarea eficacităţii terapeutice a tratamentului cu desmopreşina sau concentrat de FvW (FvW:RCo) ⁷.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate)⁵. Se va evita tratamentul cu anticoagulante orale cu 2 săptămâni înainte, iar cu heparină cu două zile înaintea testării ; nu se va recolta de pe un cateter heparinizat⁶. Testele trebuie efectuate la distanţă de transfuzii, tratament substitutiv cu FvW, administrarea de desmopreşină⁷.

Specimen recoltat – sânge venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sânge=1/9). Presiunea realizată de garou trebuie să fie între valoarea presiunii sistolice şi cea a presiunii diastolice şi nu trebuie să depăşească 1 minut. Dacă puncţia venoasă a eşuat, o nouă tentativă pe aceeaşi venă nu se poate face decât după 10 minute⁵.

Cantitate recoltată – se vor recolta 2 vacutainere cât permite vacuumul; pentru a preveni coagularea parţială a probei se va asigura amestecul corect al sângelui cu anticoagulantul, prin mişcări de inversiune a tubului⁵.

Prelucrare necesară după recoltare – proba va fi centrifugată 15 minute la 2500g, urmată imediat de separarea plasmei şi congelarea acesteia; probele recoltate în afara laboratorului vor fi transportate în recipientul destinat probelor congelate⁵.

Cauze de respingere a probei – vacutainer care nu este plin; proba de sânge hemolizată sau coagulată; plasma care nu a ajuns congelată la laborator⁵.

Stabilitate probă – plasma separată este stabilă 4 săptămâni la  – 20ºC⁵. 

Metoda 

FvW:Ag – imunoturbidimetrică: măsoară nivelul de FvW independent de compoziţia multimerilor plasmatici (particule de latex învelite în anticorpi policlonali specifici anti-FvW aglutinează în prezenţa antigenului FvW, determinând creşterea densităţii optice, direct proporţional cu concentraţia FvW din plasma testată)⁵.

FvW:RCo – plasma pacientului este mixată cu plachete fixate în formol, în prezenţa ristocetinei, iar extensia agregării plachetare este detectată foto-optic şi este proporţională cu activitatea FvW din plasmă⁶.

Valori de referinţă⁵

 Interpretarea rezultatelor

vWD trebuie luată în considerare pentru diagnosticul diferenţial al oricărui pacient cu istoric personal şi familial de sângerare şi care are PT şi aPTT normale. aPTT poate fi prelungit în formele severe de vWD cu nivele scăzute de FVIII⁶. De asemenea numărul de trombocite este în general normal, însă la pacienţii cu tipul 2B poate să apară trombocitopenia. Timpul de sângerare este de obicei prelungit, dar poate fi normal în forme uşoare de vWD.

In tabel sunt prezentate modificările celor două teste specifice pentru FvW împreună cu activitatea FVIII în diferitele tipuri de vWD^2;6;7

In tipul 1 de vWD severitatea clinic se corelează cu FvW:RCo. Un nivel foarte scăzut al FvW:Ag sugerează tipul 3 de boală.

FvW:Ag, FvW:RCo şi activitatea FVIII trebuie măsurate pe aceeaşi probă, un raport FvW:Ag : FvW:RCo <0.7 sugerând tipul 2, iar un raport FVIII:C : FvW:Ag <0.7 sugerând tipul 2N de vWD.

In hemofilie nivelul de FvW este normal².

Limite şi intreferenţe

FvW este un reactant de fază acută, iar la pacienţii cu deficit congenital nivelul său poate creşte până la valori normale într-o serie de condiţii clinice tranzitorii, cum ar fi: stres, inflamaţie, infecţii acute, efort fizic, postchirurgical, trimestrele II şi III de sarcină, precum şi în administrarea de estrogeni^3;4;6. De aceea, este preferabilă evaluarea pacientului la distanţă de aceste situaţii. Pe de altă parte, este improbabil ca sarcina sau o reacţie de fază acută să mascheze deficitele cantitative severe sau pe cele calitative.

Acidul valproic, hipotiroidismul şi bolile cardiace valvulare pot scădea FvW³.

Obţinerea de nivele la limita inferioară a normalului atât pentru FvW:Ag cât şi pentru FvW:RCo nu exclude diagnosticul de vWD (tipul 1), fiind necesară repetarea testării⁷.

Aceste teste nu diferenţiază între tipurile 2A versus 2B, respectiv 2M, sau tipul plachetar (pseudo-vWD), fiind necesare testarea agregării plachetare induse de ristocetină şi/sau analiza multimerilor FvW⁵. De asemenea testele genetice pot fi necesare pentru diferenţierea unor tipuri 2B de tipul 2A.

Testul care determină activitatea cofactorului ristocetinei este diferit de cel care măsoară agregarea plachetară indusă de ristocetină, care utilizează trombocitele şi plasma proaspătă ale pacientului şi care este util în special pentru tipul 2B şi tipul plachetar (pseudo-vWD) ³.

Prezenţa factorului reumatoid, anticorpilor anti-albumina bovină sau anti-iepure pot duce la supraestimarea nivelului FvW:Ag.

Plasma tulbure poate duce la subestimarea nivelului de FvW:Ag⁵.

Bibliografie