Cultura si identificare fungi (cu antifungigrama dupa caz)

Informatii generale

Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care contin chitina in peretele celular.

Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si acceptat in micologia medicala. Acesta permite impartirea fungilor in trei tipuri principale⁶:

• filamentosi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare ce pot fi septate, denumite hife;
• levuriformi – microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita ce se multiplica in principal prin burjeonare;
• dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot aparea sub 2 forme, in functie de conditiile de mediu: forma de levuri se gaseste in tesuturile organismelor parazitate sau la 37˚C in vitro, iar forma filamentoasa apare cand sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30˚C, pe medii uzuale.

Infectiile fungice si in special cele determinate de levuri au crescut semnificativ in ultimii ani.

Semnificatia clinica a levurilor din prelevatele patologice: 

Limita dintre patogen si nepatogen poate fi este foarte greu de precizat, levuri considerate nepatogene cu 1-2 decenii in urma sunt astazi recunoscute ca agenti patogeni in cazul gazdelor imunocompromise.

Aparitia conflictului intre levuri si gazda este favorizata de o serie de factori endogeni sau exogeni, care fie induc gazdei o stare de imunosupresie, fie modifica cantitativ raportul existent intre levuri si celelalte categorii de microorganisme.

Factorii favorizanti endogeni sunt reprezentati de: varsta (nou nascuti prematuri, varsta a III-a), starile fiziologice particulare (graviditatea). Factorii favorizanti exogeni includ: corticoterapia, terapia imunosupresoare post-transplant, antibioticoterapia prelungita, intubatia endotraheala prelungita, dispozitivele protetice, radioterapia.

Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite in laboratorul clinic in urmatoarele situatii: contaminarea probei prin manevre defectuoase in cursul prelevarii, colonizarea cu levuri a unor suprafete (tegument, mucoase) sau cavitati, infectia cu aceste microorganisme.

In cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenta levurilor indica infectie, daca s-au luat toate masurile de prevenire a contaminarii in timpul recoltarii. In cazul probelor provenite din situsuri nesterile, cu microbiota proprie, coroborarea datelor clinice, epidemiologice si de laborator este absolut necesara pentru interpretarea semnificatiei clinice a levurilor^1;2;3.

In functie de situsul de  izolare, fungii cei mai frecvent intalniti sunt:

• Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum;.
• Sange: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie, Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides immitis, Malassezia furfur;
• Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Penicillium spp., Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;
• Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Geotrichum candidum, Fusarium spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum, Coccidioides imitis;
• Piele si fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Geotrichum spp., Cladosporium spp.,  Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum, Microsporum spp., Criptococcus neoformans^1;2;3;5. 

Recoltarea si transportul probelor – joaca un rol important in acuratetea diagnosticului, orice intarziere in procesarea probelor poate duce la scaderea sanselor de a  izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de frig, fiind recomandat ca transportul probelor sa se faca la temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp (aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si identificarii fungice, cele mai importante specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural, tesuturi din plagi, lichid cefalorahidian, sange, urina si materii fecale^1;2;3.

Diagnostic de laborator

In cadrul laboratoarelor Synevo pentru infectiile fungice se efectueaza doua tipuri de analize: cultura si identificare fungi cu antifungigrama pentru fungi de tip levuriform si cultura si identificare fungi dermatofiti.

In cadrul examenului cultura si identificare fungi cu antifungigrama se urmareste izolarea in special a levurilor.

Diagnosticul complet consta in examen microscopic si cultura.

Examenul microscopic urmareste prezenta, forma si dimensiunile formatiunilor levurice: blastospori, pseudohife, hife, eventual artrospori. Detalii precum prezenta sau absenta capsulei, modul de inmugurire vor fi retinute ca aspecte importante pentru viitoarea identificare. La pacientii sub tratament antifungic este posibila evidentierea levurilor la examenul microscopic in absenta cresterii acestora pe mediile de cultura.

Cultivarea produselor patologice se face pe agar Sabouraud cu Chloramfenicol si Gentamicina, mediu care inhiba multiplicarea bacteriilor contaminante si permite o buna dezvoltare a levurilor.

Pe mediile de cultura levurile de interes medical se dezvolta in 48-72 de ore de incubare, in anumite suspiciuni diagnostice perioada de urmarire prelungindu-se pana la 7 zile.

Temperatura de incubare dupa insamantare este in concordanta cu zona anatomica de provenienta a probei: 36-37°C pentru prelevatele interne si profunde sau de 30°C pentru prelevatele superficiale (piele si fanere).

Dupa obtinerea primoculturii se verifica obligatoriu puritatea acesteia, deoarece contaminarea bacteriana compromite etapele ulterioare de identificare a speciei. In acest scop se efectueaza frotiuri colorate Gram care vor fi examinate la microscop cu obiectivul de imersie. In cazul prezentei bacteriilor se fac repicari in vederea purificarii culturii^1;3;5;6.

Identificarea culturilor si determinarea sensibilitatii la antifungice

Uzual, se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri si un test enzimatic. Cu ajutorul acestui sistem se pot identifica urmatoarele specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula.

Pentru determinarea sensibilitatii la antifungice se foloseste tot un sistem standardizat, ce permite testarea urmatoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol.

Pentru tulpinile ce nu pot fi identificate utilizand sistemul mentionat anterior, se foloseste un alt sistem biochimic bazat pe fermentarea a 13 zaharuri si 3 teste enzimatice, ce permite identificarea urmatoarelor specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum spp., Prototheca wickerhamii.

Determinarea sensibilitatii la antifungice pentru aceste specii se face cu ajutorul unui sistem standardizat ce permite testarea la: Amfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, 5-Fluorocytosine, Itraconazol.

In cazul in care din produsele patologice se dezvolta fungi filamentosi, identificarea acestora se realizeaza pe baza aspectului macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare. Antifungigrama nu se efectueaza in cazul izolarii acestor specii de fungi⁴.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Laboratory methods in basic mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 629-716.

2. Deanna A. Sutton Specimen Collection, Transport and Processing: Mycology. Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Robert H. Yolken, Ellen Jo Baron, James H. Iorgensen. In Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007,1728-1737.

3. Koneman’s, Mycology. In Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 21: 1153-1247.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010 Ref. Type: Catalog

5. Malcolm D. Richardson & David Warnock. In Fungal infection, Diagnosis and Management, 3rd ed., 2003, 2,14-28.

6. Mihai Mares, Olimpia Bazgan, Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi : Dumitru Buiuc, Marian Negut – Tratat de Microbiologie Clinica. Editia a II-a, Edit. Medicala 2008,38, 953-1030.