Diagnostic molecular infecții gastrointestinale (virusuri, bacterii, paraziți) – testare sindromică

Informații generale – Diagnostic molecular infecții gastrointestinale (virusuri, bacterii, paraziți) – testare sindromică

Infecțiile gastrointestinale reprezintă un grup de afecțiuni de etiologie virală, bacteriană sau parazitară care se manifestă cel mai frecvent ca boală diareică. Se transmit preponderent pe cale fecal-orală și sunt favorizate de lipsa sanitației și de igienă personală precară, având un impact mult mai mare în țările în curs de dezvoltare. Cei mai comuni agenți etiologici ai bolii diareice raportați la nivel mondial sunt Rotavirus și Escherichia coli (E. coli), însă prevalența etiologiei diferă semnificativ în funcție de localizare, grupe de vârstă, status socio-economic, etc.1.

Diagnosticul infecției gastrointestinale este important deoarece simptomatologia (diaree – scaune lichide, vărsături, transpirație) poate avea consecințe grave pe termen scurt (depleția apei și electroliților din organism) cu evoluție potențial letală dacă nu se intervine pentru restabilirea echilibrului hidroelectrolitic. Conform Centrului de Control și Prevenție a bolilor (CDC), boala diareică este a doua cea mai comună cauză de deces la copiii sub 5 ani la nivel mondial2.

Diagnosticul molecular al etiologiei infecțiilor gastrointestinale permite testarea simultană a mai multor clase de agenți patogeni (virusuri, bacterii, paraziți) dintr-o singură probă de scaun și oferă un rezultat rapid în vedera administrării unei medicații corecte și țintite.

Metoda inovativă real-time PCR multiplex permite identificarea materialului genetic (ARN sau ADN) a celor mai comuni patogeni implicați în patologia gastrointestinală cu o sensibilitate net superioară metodelor tradiționale și cu capacitatea de a identifica coinfecțiile sau infecțiile cu agenți patogeni dificil de diagnosticat prin coprocultură sau examen microscopic coproparazitologic.

Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară nu exclude folosirea metodelor tradiționale, deoarece după identificarea agentului patogen este indicată folosirea unei astfel de metode de identificare pentru a testa sensibilitatea la agenții antimicrobieni (antibacteriene, antifungige) și, de asemenea, este indicată și pentru verificarea evoluției post-tratament.

Virusuri cu tropism gastrointestinal

Infecția gastrointestinală virală se manifestă, de obicei, ca infecție acută cu simptome precum: diaree apoasă, greață, vărsături, dureri abdominale colicative (crampe) și, ocazional, febră și afectează preponderent extremele de vârstă (sugari, bătrâni) și persoanele imunodeprimate. Norovirusul, Rotavirusul, Astrovirusul, Adenovirusul și Sapovirusul sunt cele mai frecvente cauze ale gastroenteritei virale.

Norovirus GI/GII

Norovirusurile formează un grup de virusuri ARN monocatenar aparținând familiei Caliciviridae care se transmit prin ingestie de alimente sau apă contaminate cu fecale și prin contact direct cu persoane infectate. Gastroenterita cu norovirus se poate dezvolta la toate vârstele, în special la adulți, fiind cauza principală a focarelor acute de gastroenterită în țările industrializate.

Rotavirus

Rotavirusul este un virus ARN dublu catenar din familia Reoviridae care se transmite prin ingestia de alimente sau apă contaminate cu fecale și prin contact direct cu persoane infectate. Gastroenterita cu rotavirus are de obicei o apariție sezonieră, în timpul iernii și afectează preponderent copiii, care pot dezvolta forme severe de diaree apoasă, asociate adesea cu vărsături, febră și dureri abdominale.

Adenovirus F (ADV-F; serotip 40/41)

Adenovirusul uman (HAdV) face parte din familia Adenoviridae și este un virus ADN dublu catenar liniar. Adenovirusurile umane sunt clasificate în șapte subgrupe (Adenovirus A- G) din care tipurile ADV-F40 și ADV-F41 prezintă un tropism gastrointestinal pronunțat provocând gastroenterită acută cu febră, diaree, vărsături și dureri abdominale. Aceste tipuri de adenovirusuri se transmit doar pe cale fecal-orală și sunt o cauză majoră de mortalitate infantilă asociată bolilor diareice.

Astrovirus

Astrovirusul este un virus ARN monocatenar din familia Astroviridae care se transmite pe cale fecal- orală, prin alimente și apă contaminate și prin contact direct cu persoane infectate. Acest virus afectează preponderent copiii mici și se manifestă ca o diaree apoasă ușoară care durează de obicei 2-3 zile și poate provoca, în cazuri rare, deshidratare severă.

Sapovirus

Sapovirusurile sunt virusuri ARN monocatenare din familia Caliciviridae și sunt clasificate în cinci genotipuri (I, II, III, IV și V) din care I, II, IV și V sunt capabile să infecteze omul. Aceste virusuri se transmit pe cale fecal-orală și reprezintă a doua cea mai răspândita cauză a gastroenteritei virale la copii, dupa Norovirus.

Bacterii – patogene gastrointestinale

Gastroenterita bacteriană este o inflamație a tractului gastrointestinal (stomac și intestine) care se manifestă de la forme ușoare până la severe și include: diaree apoasă, greață și vărsături, febră, frisoane, dureri abdominale și diaree cu sânge în cazuri severe. Contractarea infecției bacteriene se realizează cel mai frecvent prin ingestia de alimente sau apă contaminate sau prin contactul cu persoane infectate. Gastroenterita bacteriană este cauza majoră a “diareei călătorilor”, principala boală infecțioasă raportată la persoanele care călătoresc în străinătate.

Shigella spp./EIEC

Speciile de Shigella se transmit pe cale fecal-orală, prin contactul personal cu o persoană infectată sau prin consumul de alimente sau apă contaminată, de aceea, pentru a preveni boala, este importantă spălarea atentă a mâinilor3.

Speciile de Shigella (S. boydii, S. dysenteriae, S. flexneri și S. sonnei) și E. coli enteroinvaziv (EIEC) determină gastroenterită prin distrugerea și inflamarea mucoasei colonului cu manifestări ce includ: diaree, febră și dureri gastrice și, în unele cazuri, scaune cu sânge. Infecția este de obicei limitată la tractul gastrointestinal, deși pot fi observate și manifestări extraintestinale: artrită reactivă, sindrom hemolitic-uremic și complicații neurologice.

Campylobacter spp.

Campylobacter este un bacil gram negativ microaerofil, curbat sau spiralat, care are motilitate prin flagel. Campylobacter este răspândit la nivel mondial, iar călătoriile internaționale reprezintă un factor de risc pentru infecție.

Infecția apare după consumul de alimente contaminate, în special păsări de curte, lapte nepasteurizat și apă. C. jejuni și C. coli sunt speciile comune care determină gastroenterita bacterienă cu boală diareică, rareori amenințătoare de viață în cazul persoanelor imunodeprimate. Debutul simptomelor apare de obicei la 24-72 de ore de la ingestie. Aproximativ 1 din 1.000 de infecții diagnosticate dezvoltă sindromul Guillain-Barré, o paralizie care necesită îngrijiri medicale de urgență4.

Yersinia enterocolitica

Infecția cu Y. enterocolitica poate fi contractată prin consumul de alimente contaminate, lapte și produse lactate, carne crudă, carne de pasăre, ouă, legume, fructe de mare și se manifestă cu precădere la copii în sezonul rece, printr-o varietate de simptome, cum ar fi febră, dureri abdominale și diaree cu sânge. Deși gastroenterita cauzată de Yersinia este adesea autolimitată, unii pacienți dezvoltă infecții cronice, cum ar fi artrita reactivă, eritem nodos, glomerulonefrită sau miocardită5.

Vibrio spp.

Speciile bacteriene Vibrio (V. cholerae, V. parahaemolyticus și V. vulnificus) sunt bacterii gram negative, în formă de tijă, care trăiesc în mod natural în apă sărată și în mediul marin și sunt dobândite prin expunerea la apă de mare sau prin consumul de fructe de mare crude sau insuficient preparate. Atunci când sunt ușoare, simptomele holerei sunt adesea imposibil de distins de alte cauze ale diareei. Cu toate acestea, mai frecvent, pacienții dezvoltă o deshidratare severă, adesea cu crampe abdominale, greață, vărsături și febră și chiar pot deceda din cauza diareei apoase acute6.

Clostridium difficile toxina B

difficile este unul dintre factorii etiologici majori ai infecțiilor nosocomiale, fiind cauzată de tratamentul cu antibiotice sau de perturbarea florei intestinale și care afectează frecvent vârstnicii. Patogenitatea C. difficile este determinată de prezența toxinelor, sporularea și rezistența antimicrobiană, iar toxina B este cunoscută că joacă un rol important rol în patogenitate.

Nu toți pacienții colonizați dezvoltă simptome. Majoritatea sugarilor sunt colonizați cu C. difficile și sunt asimptomatici. Atunci când este prezentă, infecția cu C. difficile se manifestă prin diaree cu/fără sânge, febră, dureri abdominale, vărsături, ileus și deshidratare. Megacolonul toxic și peritonita sunt complicații semnificative ale infecțiilor avansate. De reținut, mulți pacienți tratați cu succes vor continua să aibă rezultate pozitive la testare timp de săptămâni sau luni după remisiunea simptomelor; un tratament suplimentar nu este nici necesar, nici eficace7.

Aeromonas spp.

Aeromonas (A.caviae, A. hydrophila și A. veronii biotip sobria) este prezent în apa dulce și sărată și determină gastroenterită, fiind adesea izolat din probele prelevate de la pacienții cu “diareea călătorilor”.

Aeromonadele au fost asociate cu o mare varietate de boli infecțioase: gastroenterite, infecții ale plăgilor, infecții respiratorii, infecții ale tractului urinar și septicemii. Cu toate acestea, Aeromonadele sunt cel mai frecvent asociate cu enteropatia gastrointestinală. Simptomele includ diaree apoasă (cu evoluție autolimitată), febră, dureri abdominale vărsături, diaree cu sânge și posibilă deshidratare secundară8.

Salmonella spp.

Salmonella face parte dintr-un grup de bacterii care se transmite prin consumul de alimente de origine animală contaminate, în principal carne de pasăre, ouă și lapte și determină simptome ca febră, dureri abdominale, diaree, greață și uneori vărsături care apar, de obicei, la 12-72 de ore după ingerarea alimentului contaminat. În funcție de serotip, simptomele date de Salmonella pot varia de la o gastroenterită autolimitată și diaree până la o infecție sistemică cu febră, dificultăți respiratorii, complicații hepatice și splenice și leziuni neurologice. Impactul major al acestei infecții este în cazul copiilor și a vârstnicilor, precum și în cazurile în care bacteriile ajung în sânge deoarece, simptomele pot deveni severe și pot pune viața în pericol9.

E. coli + C. difficile

Escherichia coli (E.coli) este o bacterie facultativ anaerobă care colonizează tractul intestinal și care, în urma dobândirii unor caractere de patogenitate poate provoaca diaree. Tulpinile diareigene sunt: E.coli enteropatogen (EPEC), E.coli enterotoxigenic ( ETEC), E.coli producătoare de toxina Shiga (STEC) împreună cu subgrupul E.coli enterohemoragic (EHEC), E.coli enteroinvaziv (EIEC) și E.coli enteroagregativ (EAEC).

STEC

Toxina Shiga (Stx) este enterotoxina secretată de E.coli – STEC si de Shigella spp. care provoacă gastroenterită care se poate manifestă cu diaree cu sânge (colita hemoragica), diaree fără sânge sau sindrom hemolitic-uremic (S H-U).

E.coli O157

Serotipul O157 apartine unei tulpini patogene E.coli – EHEC sau STEC care provoacă cazuri clinice grave cu diaree acută, colită hemoragică și sindrom hemolitic uremic (S H-U).

E.coli enteropatogenic (EPEC)

EPEC este un agent patogen important care infectează copii cu vârsta sub 2 ani în tările în curs de dezvoltare.

E.coli enterotoxigenic (ETEC)

ETEC este principala cauza a” diareei călătorilor” și se manifestă în toate grupele de vârstă în zonele cu igienă precară.

E.coli enteroagregativ (EAEC)

EAEC este a doua cea mai frecventa cauza a ” diareei calatorilor” dupa ETEC ambele întâlnite în țările în curs de dezvoltare și asociate cu diaree persistentă.

Clostridium difficile hipervirulent

difficile este unul dintre factorii etiologici majori ai infecțiilor nosocomiale, fiind cauzată de tratamentul cu antibiotice sau de perturbarea florei gastrointestinale afectând frecvent adulții și vârstnicii spitalizați. Tulpina hipervirulentă produce mai multă toxină A și B din cauza unei mutații la nivelul genei reglatoare (gena tcdC), având rezistență de nivel înalt la fluorochinolone.

Paraziți – protozoare patogeni gastrointestinali

Protozoarele enterice determină boli diareice cu forme severe în cazul pacienților imunodeprimați, cu morbiditate și mortalitate semnificativă atât în regiunile dezvoltate, cât și în cele în curs de dezvoltare.

Giardia lamblia

Protozoarul G. lamblia (sin. G. duodenalis și G. intestinalis), cel mai frecvent parazit enteric, determină giardioza care este una dintre cele mai frecvente cauze nonvirale de diaree în rândul copiilor.

Unele cazuri pot fi asimptomatice; însă atunci când sunt prezente, simptomele includ diaree, balonare, malabsorbție, greață, vărsături și crampe abdominale. Infestările sunt în mod normal autolimitate, dar la copii poate apărea diaree cronică, provocând malabsorbție cu pierdere în greutate și cu întârzierea creșterii și dezvoltării..

Giardioza acută poate mima enterita virală acută, dizenteria bacilară, amibiaza intestinală acută și boala inflamatorie intestinală10.

Entamoeba histolytica

histolytica este un protozoar amiboid patogen pentru care omul este principalul rezervor și care determină amibiaza întâlnită cu precădere în țările în curs de dezvoltare. Tabloul clinic poate varia de la asimptomatic până la boli gastrointestinale și boli invazive, care pot avea un impact negativ asupra creșterii copiilor. Simptomele includ diaree hemoragică, oboseală, greață, febră, scădere ponderală. Amibiaza intestinală poate mima diareea infecțioasă, boala inflamatorie intestinală, colita ischemică, diverticulita, malformația AV.

Amibiomul poate mima carcinomul de colon. Stricturile amibiene pot mima limfogranulomul veneric (Chlamydia) și malignitatea. Amibiaza hepatică poate mima abcesul hepatic piogen, hepatomul necrotic și chistul echinococic11.

Cryptosporidium spp.

Cryptosporidium (C. hominis sau C. parvum.) este un parazit protozoar de importanță medicală și veterinară care provoacă gastroenterita la o varietate de gazde vertebrate. Infestarea se răspândește pe cale fecal-orală și, indirect, prin intermediul apei contaminate. Cryptosporidium este o cauză frecventă a epidemiilor cu transmitere prin alimente și apă. La pacienții imunocompetenți, infestarea este autolimitată. Alte simptome includ febră, greață, vărsături și dureri abdominale. Simptomele pot fi ciclice. Acesta poate pune în pericol viața pacienților imunocompromiși. Criptosporidioza enterică poate mima sindromul de malabsorbție, giardioza și diareea virală. Criptosporidioza biliară poate mima colangita acută12.

Blastocystis hominis

B. hominis populează ileonul și cecul, este unul dintre cei mai frecventi paraziți intestinali întâlniți la om și la animale, fiind considerat pentru mult timp nepatogen, însă există studii recente care susțin rolul său ca agent patogenic. Atunci când sunt prezente, simptomele includ greață, anorexie, dureri abdominale, flatulență, diaree acută/cronică, constipație, prurit anal, oboseală, dureri articulare și urticarie. Este asociat cu sindromul intestinului iritabil, fiind de trei ori mai frecvent la acești pacienți13.

Dientamoeba fragilis

D. fragilis este un parazit patogen cu o răspândire mondială care s-a dovedit că provoacă boală gastrointestinală acută (diareea si durerile abdominale) care poate evolua spre cronicizare. Deși mulți pacienți sunt asimptomatici, D. fragilis a fost asociat cu diaree, dureri abdominale, greață, scădere ponderală, anorexie și flatulență14.

Cyclospora cayetanensis

C. cayetanensis este un protozoar care infectează tractul gastrointestinal și provoacă boală diareică acută atât la oameni imunodeprimați, cât și la oameni imunocompetenți. C. cayetanensis a fost identificată ca o cauză importantă a bolilor diareice endemice sau epidemice la copii și adulți din întreaga lume.

Ciclosporioza este marcată de diaree profuză, fără sânge, apoasă, anorexie, oboseală, scădere ponderală, greață, flatulență, crampe abdominale, mialgii, vărsături și subfebrilitate.

Simptomele încep la aproximativ 7 zile de la ingestie. Dacă nu este tratată, poate dura de la săptămâni până la luni, cu simptome remitente și recidivante. Ciclosporioza poate mima enterita virală acută și diareea călătorului15.

Recomandări de testare:

boală diareică acută cu sau fără sânge în scaun, crampe și dureri abdominale, greață și vărsături, febră, etc. care nu se rezolvă cu tratament simptomatic;
afectare gastrointestinală cronică;
suspiciune de toxinfecție alimentară;
persoane cu simptomatologie gastrointestinală instalată în urma spitalizării;
pacienți cu status imun compromis (de ex. infecție HIV) cu suspiciune de infecție cu patogeni oportunoști (de ex Cryptosporidium spp.).

Pregătire pacient – recoltarea probelor înaintea instituirii oricărui tratament antimicrobian.

Specimen recoltat – materii fecale în mediu de transport lichid.

Recipient de recoltare – Fecal Swab

Stabilitate proba – proba de materii fecale recoltată în mediu de transport este stabilă 2 zile la 2- 8°C și 1 luna la -20°C.

Metodă – Multiplex real-time PCR.

Vor fi analizați următorii agenți patogeni:

GI-Virusuri

Norovirus GI/GII (NVG1/NVG
Rotavirus A (RO
Adenovirus F (ADV-F; serotype 40/41)
Astrovirus (ASV
Sapovirus (SV)

GI-Bacterii (I)

Shigella /EIEC
Campylobacter
Yersinia enterocolitica
Vibrio spp
Clostridium difficile toxin B
Aeromonas
Salmonella

GI-Bacterii (II)

Shiga toxi
Enteropathogenic coli (EPEC)
Enterotoxigenic coli (ETEC
Enteroaggregative coli (EAEC)
coli O157
Clostridium difficile hypervirulent

GI-Paraziți

Giardia lamblia (GL)
Entamoeba histolytica (EH)
Cryptosporidium (CR
Blastocystis hominis (BH)
Dientamoeba fragilis (DF)
Cyclospora cayetanensis (CC)

Interpretarea rezultatelor, limite şi interferenţe

Rezultatele testului se raportează calitativ, astfel:

Nedetectabil
Pozitiv cu comunicarea tipului/ tipurilor de agenți patogeni prezenți în probă.

Bibliografie

Diarrhoeal disease (who.int),

Diarrhea; common illness, global killer, Diarrhea; common illness, global killer (cdc.gov)
Puzari M, Sharma M, Chetia P. Emergence of antibiotic resistant Shigella species: A matter of concern. Journal of infection and public health. 2018;11(4):451-454
Kaakoush NO, Castaño-Rodríguez N, Mitchell HM, Man SM. Global epidemiology of Campylobacter infection. Clinical microbiology reviews. 2015;28(3):687-720
Wielkoszynski T, Moghaddam A, Bäckman A, et al. Novel diagnostic ELISA test for discrimination between infections with Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 2018;37(12):2301-2306
Learoyd TP, Gaut RM. Cholera: under diagnosis and differentiation from other diarrhoeal diseases. Journal of Travel Medicine. 2018;25(suppl_1):S46-S51
Leffler DA, Lamont JT. Clostridium difficile infection. New England Journal of Medicine. 2015;372(16):1539-1548
van Zwetselaar M, Nyombi B, Sonda T, et al. Aeromonas caviae mimicking Vibrio cholerae infectious enteropathy in a cholera-endemic region with possible public health consequences: two case reports. Journal of medical case reports. 2018;12(1):71-71
Gayet R, Bioley G, Rochereau N, Paul S, Corthésy B. Vaccination against Salmonella infection: the mucosal way. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2017;81(3):e00007-00017
Beatty JK, Akierman SV, Motta JP, et al. Giardia duodenalis induces pathogenic dysbiosis of human intestinal microbiota biofilms. International journal for parasitology. 2017;47(6):311-326
Herbinger K-H, Fleischmann E,Weber C, Perona P, LöscherT, Bretzel G. Epidemiological, clinical, and diagnostic data on intestinal infections with Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar among returning travelers. Infection. 2011;39(6):527-535.
Bouzid M, Kintz E, Hunter PR. Risk factors for Cryptosporidium infection in low and middle income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS neglected tropical diseases. 2018;12(6):e0006553-e0006553
Nagel R,Traub RJ, Kwan MM, Bielefeldt-Ohmann H. Blastocystis specific serum immunoglobulin in patients with irritable bowel syndrome (IBS) versus healthy controls. Parasites & vectors. 2015;8(1):453.).
Mohapatra S, Singh DP, Alcid D, Pitchumoni CS. Beyond O&PTimesThree.The American journal of gastroenterology. 2018:1; Mohapatra S, Singh DP, Alcid D, Pitchumoni CS. Beyond O&PTimesThree.The American journal of gastroenterology. 2018;113(6):805-818.
Midha A, Janek K, Niewienda A, et al.The Intestinal Roundworm Ascaris suum Releases Antimicrobial FactorsWhich InterfereWith Bacterial Growth and Biofilm Formation. Frontiers in cellular and infection microbiology. 2018;8:271
Soil-transmitted helminth infections (who.int)
CDC – DPDx – Microsporidiosis