Profil anticorpi antineuronali-Blot (Amfifizină, CV2, PNMA2 (Ma2/Ta), Ri, Yo, Hu, Recoverin, SOX1)

Informații generale și recomandări pentru determinarea anticorpilor anti-neuronali

Anticorpii anti-neuronali reprezintă o categorie specială de autoanticorpi ce asociază cu sindroamele neurologice paraneoplazice.

Sindroamele neurologice paraneoplazice (paraneoplastic neurological syndromes, PNSs) sunt definite ca sindroame clinice neurologice care acompaniază tumorile maligne, dar care nu sunt determinate de acestea sau de metastazele lor, nu au origine vasculară sau infecțioasă și nu constituie efecte adverse ale medicației. Aceste sindroame au la bază mecanisme imunologice al căror efect se manifestă la distanța de tumoră primară și/sau site-ul metastatic¹.

În literatură sunt utilizate două tipuri de nomenclaturi pentru anticorpii antineuronali: una dintre acestea este bazată pe primele 2 litere ale pacientului la care a fost descris prima dată anticorpul respectiv (Hu de la Hull, Yo de la Young, Ma de la Margret), iar cealaltă pe inițialele colorației imunohistochimice (ANNA = anticorpi antinucleari antineuronali)².

În funcție de tipul tumorii celulele tumorale exprimă antigene care induc formarea de autoanticorpi specifici. Acești autoanticorpi reacționează încrucișat cu antigene identice localizate la nivelul țesutului nervos și sunt probabil implicați în dezvoltarea sindroamelor paraneoplazice¹.

Din momentul în care au fost descriși pentru prima dată anticorpii anti-Hu (1985) este bine cunoscut faptul că mai mult de 2/3 din  pacienții cu sindroame paraneoplazice prezintă în ser autoanticorpi  specifici. Reacțiile antigen-anticorp nu numai că demonstrează etiologia paraneoplazică în aproape 100% din cazuri, dar sunt de asemenea strâns asociate cu tumori specifice, care până atunci nu au fost detectate la acești pacienți³. Astfel, depistarea anticorpilor anti-neuronali poate fi foarte utilă în diagnosticul precoce al tumorilor².

PNS apar în aproximativ 15% din afecțiunile neoplazice, în particular în tumorile pulmonare și gastrice. Sindroamele paraneoplazice oto-neuro-oftalmologice rezultă de obicei din encefalita de trunchi cerebral  și/sau degenerescența cerebeloasă. Acestea se pot dezvolta ca urmare a răspunsului imun față de proteine onconeurale (ca de exemplu, anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri) sau alte antigene necunoscute.

PNS apar cel mai adesea asociate cu carcinomul  pulmonar cu celule mici (SCLC), carcinomul mamar sau ovarian. Sindromul  miastenic Lambert-Eaton (LEMS), unul din cele mai frecvente PNS, prezintă cea mai mare valoare predictivă în ceea ce privește existența unei tumori de bază (în acest caz SCLC). In majoritatea PNS, în special encefalita limbică paraneoplazică (PLE), degenerescența cerebeloasă paraneoplazică (PCD), sindromul opsoclonus-mioclonus-ataxie (POMA), sindromul „stiff man” (SPS) și retinopatia paraneoplazică (amauroza subacuta), detecția anticorpilor specifici are valoare predictivă pozitivă crescută, corelându-se mai bine cu prezența tumorii de bază decât simptomele clinice propriu-zise^4;5.

Spre exemplu, PCD  este determinată  de mecanismele autoimune care apar în unele neoplazii, mai ales în stadiile precoce ale carcinoamelor mamare, ovariene, pulmonare precum și în limfomul Hodgkin. Reacția imună îndreptată împotriva antigenelor tumorale, identice cu antigenele  cerebeloase, duce la formarea de anticorpi anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri ce pot fi detectați atât în sânge cât și în lichidul cefalorahidian. Asocierea existentă între afecțiunea neoplazică și modificările cerebeloase este demonstrată prin reacția de imunofluorescență indirectă în care anticorpii anti-Yo reacționează atât cu celulele Purkinje cerebeloase cât și cu celulele carcinomatoase².

PNS nu numai că acompaniaza tumorile maligne, dar pot  fi întâlnite și în afecțiuni autoimune ca diabetul zaharat tip 1, când se poate demonstra apariția în paralel a anticorpilor specifici  anti-substanță cenușie și a celor îndreptați împotriva celulelor insulare pancreatice. Astfel, detectarea autoanticorpilor față de enzima glutamat-decarboxilază (GAD) este importantă atât pentru depistarea precoce a diabetului zaharat tip 1 cât și pentru diagnosticul unor afecțiuni neurologice, cum ar fi sindromul „stiff man” asociat cu limfomul Hodgkin⁶.

Conform recomandărilor Societății Germane de Neurologie, determinarea anticorpilor din sindroamele paraneoplazice (anticorpi antineuronali) ar trebui efectuată utilizând cel puțin două metode: screening prin  imunofluorescență indirectă și confirmare prin tehnica imunoblot. Rezultatele obținute au relevanță diagnostică numai dacă sunt concordante prin cele două metode și se integrează în tabloul clinic al pacienților^8;9.

IÎ tabelul de mai jos sunt prezentați principalii anticorpi îndreptați împotriva antigenelor neuronale intracelulare împreună cu afecțiunile neurologice asociate și cu posibilele tumori asociate^4;10:

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)⁹.

Specimen recoltat – sânge venos⁹.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator⁹.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare⁹.

Volum probă – minim 0.5 mL ser⁹.

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian⁹.

Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C⁹.

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 9 antigene care sunt fixate în cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici, aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfatază alcalină. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluția de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecție enzimatică colorimetrică. Dacă este prezent conjugatul legat reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariția unei reacții de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect⁹.

Valori de referință și interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcție de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

Valori de referință⁹

Bibliografie