Profil boli hepatice autoimune-Blot (AMA-M2, M2-3E, Sp100, PML, gp210, LKM-1, LC-1, SLA/LP, Ro-52)

Informații generale

Bolile autoimune ale ficatului  includ:

• Hepatita autoimună (AIH)
• Ciroza biliară primitivă (PBC)
• Colangita sclerozantă primitivă (PSC)¹.

Hepatita autoimună (AIH) este o boală inflamatorie cronică de etiologie neprecizată caracterizată prin prezența de autoanticorpi circulanți, hipergamaglobulinemie, tablou histopatologic cu necroza celulelor parenchimatoase și infiltrat inflamator limfoplasmocitar, precum și printr-un răspuns dramatic la terapia imunosupresoare.

Mecanismul patogenic  postulează că, pe fondul unei  predispoziții  genetice, intervenția anumitor  factori declanșatori  determină  un răspuns  imun anormal mediat de limfocitele T  ce va conduce la   leziuni ale ficatului. Date  publicate au arătat că 40% din pacienții cu boală severă netratată suferă deces în  6 luni de la diagnostic iar supraviețuitorii dezvoltă frecvent  ciroză, varice esofagiene și hemoragii.  Astfel, cu cât terapia imunosupresoare este începută  mai precoce și continuată  în mod  susținut, cu atât pacientul diagnosticat cu hepatită autoimună  are o speranță de viață  mai mare.

AIH constituie o afecțiune rară cu o incidență medie de 1-2 cazuri la 100 000 locuitori. Deși boala este întâlnită predominant la femeile tinere aceasta poate afecta copii și adulți de orice vârstă, din toate grupurile etnice.

Debutul AIH este insidios cu fatigabilitate, greață, dureri articulare și icter intermitent.

Diagnosticul se bazează pe simptomele și  semnele clinice,  testele de laborator și evidențierea  reacției inflamatorii histologice. Este importantă  excluderea  altor cauze de hepatita cronică  (virală, metabolică, genetică  sau  toxică) și delimitarea de celelalte boli autoimune  hepatice. Principalele criterii pentru diagnosticul AIH  sunt următoarele:

• Evidența histologică a hepatitei
• Detecția de autoanticorpi (ANA, ASMA, LKM, SLA/LP)
• Hipergamaglobulinemia
• Teste serologice   negative  pentru HCV și HBV
• Asocierea cu antigenele HLA B8, DR3 sau DR4.

Diagnosticul  este  foarte probabil atunci când  sunt indeplinite 4 din 5 criterii  și complet când sunt întrunite toate cele 5 criterii. Răspunsul favorabil la terapia imunosupresoare confirmă diagnosticul^1;2;3;6.

În 1994  a fost propusă o clasificare a  AIH  în 3 tipuri majore: tip I (asociat cu  ANA și/sau ASMA), tipul II (asociat cu  anti-LKM1 și/sau anti-LC) și tipul III (asociat cu anti-SLA /LP). Tipul III de boală este controversat în sensul că nu este clar dacă acesta constituie o entitate în sine sau este o variantă a tipului I^2;5;6.

Autoanticorpii apar la majoritatea pacienților cu AHI, dar rolul lor în patogeneză este încă discutabil. De  asemenea, nu  există o corelație clară între  activitatea  sau prognosticul bolii  și titrul de autoanticorpi.

Principalii autoanticorpi  asociați cu  AIH  sunt:

• Anticorpii antinucleari (ANA)
• Anticorpii anti – fibră musculară  netedă (ASMA)
• Anticorpii anti-LKM1
• Anticorpii anti-LC1 (liver cytosol type 1)
• Anticorpii anti-SLA (soluble liver antigen)/LP (liver-pancreas)^1;4;6.

Anti-LKM1  recunosc ca antigen țintă citocromul p450 2D6 (CYP2D6)  de 50 kDa, antigen microsomal din reticulul endoplasmic. Anticorpii sunt  îndreptați către un epitop situat între aminoacizii 263-270 ai CYP2D6. Expresia acestui antigen la suprafața  hepatocitelor ar putea sugera rolul patogenic al acestor anticorpi. Ei se întâlnesc cu o frecvență  mai mare în populația pediatrică unde  titrul lor poate fi utilizat pentru a monitoriza  activitatea bolii și răspunsul la tratament.  Anti-LKM1 mai pot fi întâlniți cu frecvență redusă (1-2% din cazuri) la pacienții având hepatită cronică cu virus C precum și în hepatita la halotan.

ASMA  sunt îndreptați împotriva unor structuri din  componența citoscheletului  ca actina, troponina, tropomiozina, vimentina (predominant  împotriva F-actinei). ASMA  au fost   detectați prin imunofluorescență indirectă pe stomac, rinichi  și ficat de rozătoare, deoarece acestea conțin cantități crescute de actină în structura musculară. Autoanticorpii anti-actină  se asociază cu debutul precoce al  bolii (au relevanță crescută în patologia  pediatrică), cu prezența haplotipului  HLA A1-B8-DR3, cu recăderi frecvente ale tratamentului și cu indicație de transplant^1;4;7.

Anti-SLA au fost descriși în 1987 ca fiind îndreptați împotriva  unei proteine din citosol care se găsește în concentrații crescute în țesutul hepatic și renal. Anti-LP au fost descriși înaintea anti-SLA (1981), de către un grup diferit de cercetători, ca având reactivitate față de o proteină solubilă dintr-un lizat omogen de ficat și pancreas. Ulterior s-a demonstrat  că anti-SLA si anti-LP sunt  identici (anti SLA/LP) și că antigenul țintă este reprezentat de o proteină citosolică de 50 kDa ce este implicată în biosinteza seleno-proteinelor (UGA-suppressor serine-tRNA-associated protein). Acești anticorpi sunt înalt specifici pentru AIH  având o prevalență de 10-30%^1;2;6.

Anti-LC1 apar in AIH tip II, fiind detectați la 50% din serurile LKM  positive. Unii autori  îl asociază cu ANA și ASMA și  de asemenea cu  hepatita cronică cu virus C. Ei  recunosc ca antigen țintă  formiminotransferaza-ciclodeaminaza  și se corelează cu activitatea bolii^2;6;7.

Alți  anticorpi care  mai pot apărea în AIH sunt :

• p-ANCA atipici
•  anti-LKM3 (ținta antigenică este reprezentată de de uridin-difosfat glucuronoziltransferaza și sunt întâlniți la pacienți cu hepatită cronică D și AIH tip II)
• anti-LKM2 (îndreptați împotriva CYP2C9 și asociați cu  hepatita  la ticrynafen)
• anti-receptor pentru asialoglicoproteine (ASGP-R, sunt întâlniți atât la pacienți cu AIH cât și cu hepatită virală; se corelează cu activitatea histologică)¹.

Diversitatea serologică  a anticorpilor a condus la ipoteza că AIH reprezintă un grup heterogen de boli. Această ipoteză este susținută de asocierea  în 10-18 % din cazuri a unui sindrom multiorganic (APECED) caracterizat prin candidiază mucocutanată cronică, distrofie ectodermală și distrucție tisulară autoimună a diferitelor glande endocrine (hipoparatiroidism, insuficiență suprarenaliană, hipogonadism)^1;7.

 Ciroza  biliară primitivă (PBC)  apare în 90% din cazuri la femei de vârstă mijlocie. Incidența bolii în diferite regiuni ale lumii este de 4-31 cazuri /1 million locuitori/an. Clinic, pacienții prezintă fatigabilitate, prurit, artralgii, dureri abdominale, icter obstructiv intermitent. Patognomonici  pentru această afecțiune  sunt anticorpii antimitocondriali (AMA) care  apar la 95% din pacienți. Ei sunt îndreptați asupra subunității E2  a complexului piruvat dehidrogenazei (PDC-E2). Acest  antigen  este exprimat  la nivel hepatic,  în jurul ductelor biliare, iar autoanticorpii vor duce la distrucția canaliculelor biliare cu colestază secundară. Diagnosticul PBC este luat în considerare  dacă:

Boala poate afecta atât ficatul cât și glandele cu funcție exocrină (glande salivare, lacrimale, pancreas). Titrurile AMA crescute   susțin diagnosticul de PBC și pot avea  valoare predictivă pentru dezvoltarea  ulterioară de PBC  la pacienți cu simptome  de  colestază. AMA mai pot fi detectați și în sindroame  overlap PBC-AIH, scleroza sistemică (6%) și sindromul  Sjögren^1;4;5.

Alți  autoanticorpi  specifici  PBC sunt:

Anti-gp210    recunosc un antigen de 210 kDa  al membranei  nucleare și apar la 10-47% din pacienții cu PBC.

Anti-Sp100 apar  la  20% din pacienții cu PBC  și sunt îndreptați împotriva   unor structuri  numite corpi nucleari (“nuclear  dots”) care în imunofluorescența indirectă prezintă un aspect punctat și care au fost puși în evidență pentru prima dată în  nucleii celulelor maligne. Acești corpi nucleari  ce conțin fibre non-cromatiniene   reprezintă un complex alcătuit din următoarele componente: antigenul sp100, antigenul PML (promyelocytic leukemia factor), LYSP 100, NDP55 și NDP 53.

Anti-NUP62 (Nucleoporina p62)  apar în  32% din cazurile de PBC.

Mai puțin specifici pentru PBC sunt anticorpii anti receptor lamin B și anti-ciclină A.

În tabelul de mai jos este menționată sensibilitatea și specificitatea diverselor tipuri de autoanticorpi pentru PBC:

 Tratamentul PBC  impune reducerea colestazei și îmbunătățirea  funcției hepatice; constă în administrarea de acid ursodeoxicolic și colestiramină. În cazuri severe este indicat transplantul hepatic^1;3;6.

O situație aparte este reprezentată de  sindroamele overlap PBC-AIH în care anticorpii AMA  se asociază  cu  cei din AIH (10-20% din cazuri). Aceste sindroame pot coexista de la început (PBC-AIH) sau PBC poate progresa  către AIH. Identificarea sindroamelor overlap este foarte importantă datorită eficacității dovedite a tratamentului corticosteroid. Pentru diagnosticul sindroamelor overlap AIH-PBC  au fost elaborate criteriile Paris⁵:

Colangita sclerozantă  primitivă (PSC) apare cu o incidență de  4 cazuri la 100 000 locuitori/an. Tabloul clinic este dominat de simptomele și semnele de colestază. Diagnosticul  se bazează pe  modificările testelor de laborator, examenul histologic și  colangiopancreatografia  endoscopică retrogradă (ERCP). Sunt afectați în principal bărbații iar în 50% din cazuri se asociază  și colita ulceroasă. Autoanticorpii identificați în această  afecțiune  sunt  p-ANCA cu aspect atipic în imunofluorescența indirectă, îndreptați impotriva antigenelor: catepsină G, lactoferină, catalază, alfa-enolază. Aceștia  pot apărea  ocazional și  în AIH  și  PBC^1;4.

Recomandări –  pacienți cu suspiciune clinică de boli hepatice autoimune¹.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)⁷.

Specimen recoltat – sânge venos⁷.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator⁷.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare⁷.

Volum probă – minim 1 mL ser⁷.

Cauze de respingere a probei:

Stabilitate probă – serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC și timp îndelungat la -20ºC. Nu decongelați/recongelați⁶.

Metodă – imunoblot. Testul utilizează 9 antigene native și recombinate purificate, care sunt fixate  în cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va atașa la porțiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluția de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecție enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariția unei reacții de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect⁷.

Valori de referință  și interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcție de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

Valori de referință

Bibliografie