QuantiFERON TBC test

QuantiFERON-TB Gold Plus Test

Informaţii generale

Tuberculoza (TBC) reprezintă o boală infecţioasă respiratorie contagioasă produsă de bacteriile incluse în complexul Mycobaterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis şi M. africanum).

Infecţia tuberculoasă cuprinde atât forme active cât şi latente; tuberculoza latentă se produce atunci când o persoană devine expusă la M. tuberculosis iar organismul controlează infecţia dar nu reuşeşte să o eradicheze. Se estimează că aproximativ 10% din persoanele cu tuberculoză latentă vor progresa în cursul vieţii către o formă activă. Printre cauzele asociate cu reactivarea infecţiei latente se numără infecţia HIV şi tratamentele cu antagonişti de TNFα. Din acest motiv, diagnosticarea tuberculozei latente reprezintă o etapă importantă în prevenirea reactivării infecţiei în special la persoanele cu risc crescut. Tratamentul tuberculozei latente poate reduce semnificativ riscul de progresie către formele active¹.

QuantiFERON TB Gold Test, dezvoltat de firma Cellestis Limited (Australia), a fost aprobat de FDA în mai 2005 ca test in vitro cu utilitate în diagnosticul infecţiei cu Mycobacterium tuberculosis, atât pentru forma latentă cât şi pentru cea activă. În Comunitatatea Europeană testul a fost certificat pentru a fi folosit în aceleaşi situaţii în care este indicat testul la tuberculină. Testul măsoară intensitatea răspunsului imun celular față de antigenele ce simulează proteinele ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) și CFP-10 (culture filtrate protein) produse de mycobacterii. Astfel, persoanele infectate cu microorganismele incluse în complexul Mycobaterium tuberculosis prezintă în mod obișnuit în sânge limfocite T care recunosc aceste antigene. Procesul de recunoaștere include generarea și eliberarea de citokine, în special γ-interferon, ce poate fi detectat și cuantificat printr-o metodă imunoenzimatică.

Până nu demult, IDR la tuberculină a reprezentat singura metodă de diagnostic a infecţiei TBC. Deşi larg folosit, testul la tuberculină prezintă o serie de limitări. În cazul QuantiFERON-ului, care este un test de laborator efectuat din sânge, stimularea limfocitelor cu antigenele TBC are loc în tubul de flebotomie şi nu intradermic. Din acest motiv se exclude efectul de “booster” care poate să apară în cazul testului la tuberculină (efectuarea unui test cutanat la o persoană care nu a fost expusă la infecţia TBC stimulează sistemul imun şi-l determină să reacţioneze la tuberculină într-o etapă ulterioară, când se repetă testul cutanat).

Spre deosebire de IDR la tuberculină, rezultatele testului nu sunt influenţate de vaccinarea BCG; infecţiile în antecedente cu mycobacterii netuberculoase exercită de asemenea o influenţă mai redusă. Sunt eliminate şi reacţiile adverse de hipersensibilitate care pot să apară în cazul testului cutanat. De asemenea rezultatele la QuantiFERON TBC test sunt mult mai obiective, fără să intervină erori în citire şi interpretare^1;2;3;4.

Indicaţiile testului:

1. Poate fi folosit în toate situaţiile în care este utilizat în mod obişnuit testul la tuberculină:

• suspiciune clinică şi radiologică de tuberculoză activă;
• contacţii pacienţilor cu forme contagioase de TBC;
• screening-ul persoanelor cu risc crescut: personalul din unităţi sanitare şi instituţii de îngrijire, persoane provenite din medii cu igienă deficitară, etc^1;2;3.

             Un studiu din 2008 a indicat faptul că testul poate fi aplicat şi copiilor peste 2 ani în scopul diagnosticării tuberculozei latente, cu aceleaşi caracteristici de performanţă ca şi la adulţi⁵.

           Menţiune: QuantiFERON TBC înlocuieşte testul la tuberculină; nu trebuie folosite concomitent ambele teste^1;2;3.

2. Poate constitui un instrument pentru monitorizarea pacienţilor cu tuberculoză activă. Există unele studii care indică potenţiala utilitate a testului în evaluarea eficienţei tratamentului

           tuberculostatic prin urmărirea cantităţii de interferon gamma eliberate care se modifică în timp⁶. Conform unui studiu, evaluarea prin QuantiFERON la 2 luni de la iniţierea terapiei poate avea valoare predictivă semnificativă asupra probabilităţii ca la sfârşitul fazei intensive de tratament culturile din spută să rămână pozitive^6;7.

3. Poate fi folosit înaintea unei terapii imunosupresoare (de exemplu cu anticorpi anti-TNFα) sau înaintea transplantului de organe pentru a exclude o infecţie latentă cu M. tuberculosis^2;3.

Pregătire pacient – se va întrerupe terapia imunosupresoare cu cel puţin 14 zile înaintea recoltării³.

Specimen recoltat – sânge venos³.

Recipient(e) de recoltare

Se recoltează o eprubetă cu heparinat de litiu minim 10 mL de sânge sau 3 eprubete cu heparinat de litiu de 4 mL. Sângele trebuie să ajungă în 12 ore (max.16 ore) la laborator și în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea sau congelarea probei. Dacă proba nu poate ajunge în max. 16 ore în laborator, sângele va fi transferat în tuburi de transfer, conform următoarei proceduri:

• se omogenizează ușor eprubeta cu sânge heparinat care urmează a fi trasferată;
• se transferă câte 1mL de sange în fiecare din cele 4 tuburi de transfer etichetate corespunzător:

• după ce s-a transferat câte 1 mL de sânge în fiecare tub, acestea se vor agita energic de 10 ori astfel încât sângele să intre în contact cu aditivii din eprubetă.
• se incubează imediat la 37 ºC timp de 16-24 ore;
• se scot eprubetele din incubator, se lasă să ajungă la temperatura camerei și apoi se centrifughează la 3500 rpm timp de 15 minute.
• probele obținute se pot păstra la 2-8 ºC timp de 28 zile daca nu se pot lucra imediat.

Volum probă – minim 10 mL sânge heparinat³.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate, utilizarea altui anticoagulant în afara heparinatului de litiu³.

Metodă

Sângele heparinat al pacientului se incubează timp de 16-24 ore împreună cu un amestec de peptide sintetice ce simulează cele 2 proteine specifice pentru M. tuberculosis : ESAT- 6 și CFP- 10. Aceste proteine sunt produse de toate tulpinile patogene de M. tuberculosis și de tulpinile patogene de M. bovis și sunt absente absente în tulpinile incluse în vaccinul BCG cât și în majoritatea mycobacteriilor netuberculoase, cu excepția M. kansasii, M. szulgai și M. marinum. Astfel, QuantiFERON este mai specific decât testul la tuberculină în detectarea infecţiei cu M. tuberculosis. Dacă în proba de sânge sunt limfocite T cu memorie pentru aceste proteine (ceea ce se întamplă şi în cazul unei infecţii cu mulţi ani în urmă), aceste celule vor produce γ-interferon în contact cu antigenul specific.

Determinarea cantitativă a γ-interferonului eliberat în plasmă se face printr-o metodă imunoenzimatică înalt sensibilă (ELISA) iar rezultatele se exprimă în UI/mL. Se utilizează obligatoriu controale pozitive şi negative pentru a asigura validitatea testului. Controlul pozitiv este reprezentat de fitohemaglutinină (substanţa mitogenă universală) iar controlul negativ (Nil) de ser fiziologic (folosit ca un blank pentru a măsura nivelul bazal de γ-interferon). Astfel, pentru ca testul să fie valid valoarea obținută pentru controlul Nil trebuie să fie ≤ 8 UI/mL, iar valoarea obținută pentru controlul mitogen din care se scade valoarea antigenului Nil (Mitogen – Nil) trebuie să fie ≥ 0.5 UI/mL. Cantitatea finală de γ-interferon eliberată ce va fi utilizată pentru interpretarea rezultatelor va fi calculată prin scăderea valorii corespunzătoare controlului negativ (Nil) din valoarea totală obținută pentru amestecul de antigene TBC (Antigen TB – Nil)^2;3;4.

În varianta actuală îmbunătățită a testului – QuantiFERON TB Gold Plus – se folosesc pentru antigenul TBC două tuburi distincte, fiecare conținând peptide antigenice ce mimează proteinele ESAT-6 și CFP-10. Primul tub (antigen TB1) conține peptide ce sunt destinate să inducă un răspuns imun de către limfocitele T helper CD4+, în timp ce al doilea tub (antigen TB2) conține un set suplimentar de peptide ce țintesc producerea unui răspuns imun de către limfocitele T citotoxice CD8+. În istoria naturală a infecției TBC celulele T CD4+ dețin un rol esențial în controlul imunologic prin producerea de γ-interferon. Cu toate acestea, datele actuale susțin implicarea în răspunsul imun al gazdei față de infecția TBC și a limfociteler T CD8+, prin producerea de γ-interferon dar și de alți factori solubili ce activează macrofagele pentru a suprima creșterea mycobacteriilor, distruge celulele infectate sau a determina liza intracelulară directă a microorganismelor. Deși limfocite T CD8+ specifice față de antigenele M. tuberculosis au fost detectate atât la persoane cu TBC latent cât și cu TBC activ, cele îndreptate față de ESAT-6 și CFP-10 sunt prezente mai frecvent în cazurile de TBC activ și ar putea fi asociate cu o expunere recentă la agentul patogen. În plus, limfocite T CD8+ producătoare de γ-interferon au fost raportate și la persoane având TBC activ și coinfecție HIV, precum și la copiii cu infecție TBC.

Pe buletinul final de analize vor apărea cantitățile de γ-interferon corespunzătoare cele două amestecuri antigenice (AgTB1 și AgTB2)³.

Interpretarea rezultatelor

Rezultatul este considerat negativ dacă sunt îndeplinite următoarele condiții:

1. Cantitățile de γ-interferon eliberate după stimularea cu cele două amestecuri antigenice (AgTB1-Nil și AgTB2-Nil) < 0.35 UI/mL sau ≥ 0.35 UI/mL dar < 25% din valoarea obținută pentru controlul Nil;
2. Nil ≤ 8 UI/mL;
3. Mitogen – Nil ≥ 0.5 UI/mL.

În condiţiile date se poate exclude o infecţie cu Mycobacterium tuberculosis. Totuşi, la pacienţii cu infecţie cronică HIV sau alte cauze care dau o imunodeficienţă severa (tratament imunosupresor, anumite afecţiuni hematologice: leucemii, limfoame, anumite tumori solide: pulmonare sau din regiunea cap-gât, diabet, silicoză, insuficienţă renală cronică) trebuie luat în considerare statusul imun actual şi utilizate şi alte metode de diagnostic al infecţiei^1;4.

Un studiu efectuat în Japonia indică faptul că QuantiFERON TB test este mai util în diagnosticarea infecţiei tuberculoase la pacienţi imunodeprimaţi decât testul la tuberculină. Totuşi, având în vedere faptul că s-a obţinut o rată crescută de rezultate neconcludente la pacienţii cu limfopenie care primesc tratament imunosupresor rezultatele trebuie interpretate cu prudenţă la această categorie de pacienţi⁸.

În cazul unui rezultat negativ la persoanele care au venit recent în contact cu pacienţi diagnosticaţi cu forme de TBC contagios acesta va fi confirmat printr-un nou test efectuat la 6-8 săptămâni de la sfârşitul perioadei de expunere (ca şi în cazul testului la tuberculină)^1;3;4.

Rezultatul este considerat pozitiv dacă sunt îndeplinite următoarele condiții:

1. Oricare din cantitățile de γ-interferon eliberate după stimularea cu cele două amestecuri antigenice (AgTB1-Nil și/sau AgTB2-Nil) ≥ 0.35 UI/mL și ≥ 25% din valoarea obținută pentru controlul Nil;
2. Nil ≤ 8 UI/mL.

Un rezultat pozitiv indică o infecţie cu M. tuberculosis. În majoritatea cazurilor, diferenţierea dintre o infecţie latentă şi una activă nu este posibilă cu acest test.

În cazul suspiciunii clinice de tuberculoză activă rămân valabile toate metodele de diagnostic microbiologic (microscopie, cultură) şi de biologie moleculară^1;2 ;3 ;4.

Rezultat este considerat neconcludent în următoarele condiții:

1. Mitogen – Nil < 0.5 UI/mL iar AgTB1-Nil și AgTB2-Nil < 0.35 UI/mL sau ≥ 0.35 UI/mL dar < 25% din valoarea obținută pentru controlul Nil

ori

2. Nil > 8 UI/mL

Dacă recoltarea şi transportul probei s-au efectuat în condiţii adecvate, lipsa de validare a controlului mitogen indică cel mai probabil o imunosupresie severă cauzată de SIDA şi tratamentul curent cu medicamente imunosupresoare (corticosteroizi în doze mari, antagonişti ai TNFα, medicamente folosite la pacienţii cu transplant de organe)^1;3. Lipsa de validare a controlului negativ (Nil) se produce în prezenţa unei producţii bazale crescute de γ-interferon nespecifică (cel mai adesea) sau asociată cu imunizări³.

Caracteristicile de performanță al testului TBC Gold Plus

• Specificitate globală: 97.6% (95.6-98.8%)
• Sensibilitatea globală pentru TBC activ: 95.3% (90.9-97.9%).

Bibliografie

1. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. QuantiFERON®-TB Gold www.labcorp.com 2017. Ref Type: Internet Communication
2. Gerald H. Mazurek, MD, John Jereb, MD, Andrew Vernon, MD, Phillip LoBue, MD, Stefan Goldberg, MD, Kenneth Castro, MD. Updated Guidelines for Using Interferon Gamma Release Assays to Detect Mycobacterium tuberculosis Infection — United States, 2010. Division of Tuberculosis Elimination, National Center for HIV, STD, and TB Prevention, CDC. MMWR 2010; 59(RR05);1-25.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2017. Ref Type: Catalog.
4. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. QuantiFERON-TB Gold In-Tube for Detection of Latent Tuberculosis, Blood. http://www.mayomedicallaboratories.com 2017. Ref Type: Internet Communication.
5. Jennifer Lighter, MD, Mona Rigaud, MD, MPH, Roger Eduardo, BS, Chia-Hui Peng, MPH       and Henry Pollack, MD. Latent Tuberculosis Diagnosis in Children by Using the QuantiFERON-TB Gold In-Tube Test. In Pediatrics Vol. 123 No. 1 January 2009, pp. 30-37.
6. R. Markova, R. Drenska, Y. Todorova, V. Terzieva and D. Stefanova. Monitoring the efficacy of anti-TB therapy by using the QuantiFERON-TB Gold In tube test. In European Respiratory Review, 2008;17: 74-75.
7. Katiyar, S.K.; Sampath, A.; Bihari, S.; Mamtani, M.; Kulkarni, H. Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube® test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. In The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Volume 12, Number 10, October 2008 , pp. 1146-1152(7).
8. Y. Kobashi, K. Mouri, Y. Obase, M. Fukuda, N. Miyashita and M. Oka. Clinical evaluation of QuantiFERON TB-2G test for immunocompromised patients. Division of Respiratory Diseases, Dept of Medicine, Kawasaki Medical School, Kurashiki, Japan, 2008.