ДНК Хламидии (Chlamydia trachomatis) + ДНК гонорея (N. gonorrhoeae) - эндоцервикс

Инфекции Chlamydia trachomatis (CT) и Neisseria gonorrheae (GC) являются двумя наиболее распространенными венерическими заболеваниями в мире. Принимая во внимание только Соединенные Штаты Америки, центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) сообщили в 2013 году о 1 401 906 новых случаях хламидийной инфекции трахоматиса и 820 000 новых случаях инфекции Neisseria gonorrhoeae3

Хламидиоз-это грамотрицательная бактерия очень маленького размера, обязательно внутриклеточная из-за того, что она не может синтезировать свой АТФ, поскольку ее можно выращивать только в живых эукариотических клетках (эмбриональных яйцах или клеточных культурах).

Недавние классификации делят хламидии на 4 семейства, наиболее важным из которых в патологии человека является семейство Chlamydiaceae, которое содержит два рода:

• род Chlamydia – наиболее важным представителем является C. trachomatis;
• род Chlamydophila-C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus, так далее.

Хламидия трахоматис встречается почти исключительно у людей. Описано 15 сероваров, вовлеченных в различные инфекции1; 2.

Инфекция Chlamydia trachomatis является наиболее распространенным заболеванием, передающимся половым путем, по бактериальной причине. Наиболее пострадавшая возрастная группа составляет 15-25 лет, при этом распространенность инфекции составляет от 2 до 25%.

Инкубационный период заболевания обычно колеблется от 1 до 3 недель, а в некоторых случаях достигает 6 недель. Большая часть инфекций развивается бессимптомно: 75% инфекций у женщин и 50% инфекций у мужчин. В симптоматических случаях у мужчин уретрит и проктит могут возникать в острой фазе; при отсутствии лечения может возникнуть хронизация эпидидимитом, простатитом и реактивным артритом. Клинические симптомы у женщины состоят из уретрита, цервицита и бартолинита, которые могут осложняться: эндометритом, сальпингитом, тазиперитонитом, перигепатитом, а также реактивным артритом.

Бессимптомный характер многих инфекций Chlamydia trachomatis отвечает за их недиагностику с важными последствиями, особенно у женщин, из-за доказанной корреляции между нелеченной инфекцией и такими осложнениями, как внематочная беременность и бесплодие.

Будучи венерическим заболеванием обязательно обследование партнеров для предотвращения повторного заражения.

Как и в случае других заболеваний, передающихся половым путем, инфекция Chlamydia trachomatis может способствовать передаче ВИЧ-инфекции. Кроме того, новорожденные могут заразиться при прохождении через цервикальный канал конъюнктивитом, фарингитом и пневмонией 3;4;5.

Диагностика инфекций Chlamydia trachomatis включает выделение патогена в клеточных культурах, обнаружение антигена иммунологическими методами и определение ДНК с помощью молекулярных методов. Поскольку клеточные культуры трудоемки и требуют времени, они обычно не используются в качестве прерогативы некоторых специальных лабораторий3; 5

Многочисленные исследования показали, что методы амплификации ДНК обнаруживают примерно на 15% больше инфекций по сравнению с другими методами, не основанными на клеточных культурах, со специфичностью >99%. Кроме того, в тесте ДНК могут использоваться образцы, несовместимые с методами, основанными на культурах, такими как мочи у мужчин 6.

Помимо хромосомной ДНК C. trachomatis содержит загадочную плазмиду, которая является общей для всех сероваров. По этой причине молекулярные тесты нацелены на нуклеотидные последовательности на уровне этой плазмиды. В 2006 году был впервые описан шведский вариант Chlamydia trachomatis, который демонстрирует делецию 377 п. н. внутри плазмиды ДНК и не обнаруживается некоторыми коммерческими тестами 5.

Neisseria gonorrhoeae, грамотрицательный диплококк, является этиологическим агентом гонореи, одного из наиболее распространенных заболеваний, передающихся половым путем.

У мужчин инфекция в большинстве случаев симптоматическая, связана с уретритом, сопровождающимся гнойнойной секрецией. Инкубационный период составляет 1-10 дней. У женщин основной локализацией инфекции является эндоцервикс. Описана повышенная Распространенность коинфекций с Chlamydia trachomatis и Trichomonas vaginalis а также связь с бактериальным вагинозом. Многие женщины остаются бессимптомными и по этой причине не обращаются к врачу. При возникновении клинических проявлений они представлены измененными выделениями из влагалища, дизурией, диспареунией, межменструальным кровотечением. Другими возможными локализациями гонококковой инфекции являются прямая кишка, глотка, конъюнктива; редко могут возникать диссеминированные инфекции. Дети, рожденные от инфицированных матерей, могут заразиться конъюнктивитом.

При отсутствии адекватного лечения антибиотиками могут развиться острые или поздние осложнения, такие как: эпидидимит или простатит у мужчин; воспалительные заболевания органов малого таза, перигепатит, бесплодие, внематочная беременность у женщин 3;4;5.

• gonorrhoeae-лабильный микроб, который не выживает в образцах, собранных за пределами лаборатории. По этой причине микробиологическая диагностика на основе культуры в этих случаях имеет низкое значение.

Разработка методов амплификации нуклеиновых кислот улучшила выявление гонококковых инфекций, причем эти методы, очевидно, имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими методами культивирования:

• поскольку бактериальная ДНК обнаружена, микроорганизму не нужно быть жизнеспособным;
• показывает более высокую чувствительность;
• у мужчин тест можно проводить с мочой, что увеличивает соответствие пациентов исследованию6.

В заключение к вышеупомянутому Chlamydia trachomatis (CT) и Neisseria gonorrhoeae (GC) являются патогенами, наиболее часто вовлеченными в Заболевания, передающиеся половым путем, по бактериальной причине. Важно отметить, что коинфекция CT-GC сообщается примерно в 30% случаев (чаще у женщин), отсюда и необходимость комбинированного тестирования двух патогенов.

Ранняя диагностика инфекций представляет собой проблему, потому что у значительной части пострадавших людей симптомы отсутствуют. При отсутствии диагностики и лечения они могут привести к распространению инфекций у мужчин и воспалительным заболеваниям органов малого таза у женщин со значительными поздними последствиями: бесплодие, внематочная беременность, хроническая тазовая боль4;7.

В случае обеих инфекций возможна перинатальная передача с развитием конъюнктивита новорожденному. Кроме того, КТ и ГК связаны с повышенным риском передачи инфекции HIV7.

Один из лучших способов предотвратить осложнения КТ и ГК-инфекций-это скрининг подростков и молодых людей, а также беременных женщин. Если у человека диагностирована одна или обе инфекции, все сексуальные партнеры должны быть проверены и обработаны соответствующим образом4.

Руководство CDC (центры по контролю и профилактике заболеваний) рекомендует проводить скрининг с помощью тестов на амплификацию нуклеиновых кислот с высокой чувствительностью и специфичностью, подтверждая, что молекулярные методы в настоящее время составляют диагностический стандарт инфекций CT и GC3.

В нашей лаборатории используется полностью автоматизированный метод ПЦР в реальном времени, производительность которого была недавно оценена в нескольких исследованиях. Они показали, что тест имеет очень хорошую чувствительность и специфичность для качественного обнаружения ДНК КТ и НГ в урогенитальных образцах, а также демонстрирует высокую эффективность:

• для КТ: чувствительность 6-98%, специфичность ≥99.6%;
• для GC: чувствительность 9-100%, специфичность ≥99.8% 8;9.

Технически тест основан на амплификации двух последовательностей ДНК-мишеней для каждого из двух патогенов с целью уменьшения количества ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Таким образом, в случае КТ используются специальные праймеры и зонды для последовательности около 206 нуклеотидов из загадочной плазмиды, а также для последовательности приблизительно 182 нуклеотидов внутри хромосомной ДНК (ген ompA, кодирующий основной белок внешней мембраны). Для NG используются праймеры и зонды, нацеленные как на последовательность из примерно 190 нуклеотидов из высококонсервативной прямой повторяющейся области, называемой DR-9, так и на последовательность из ~ 215 нуклеотидов, идентифицированную как вариант консервативной последовательности в этой области. Кроме того, в каждый образец вводится внутренний контроль CT/NG, представленный комбинацией двух неинфекционных плазмид ДНК, которые контролируют все стадии реакции ПЦР.

Что касается аналитических характеристик, тест способен идентифицировать наряду с 14 сероварами и шведским вариантом КТ; в случае НГ нет перекрестных реакций с бактериями Neisseria cinerea, flava, lactamica, perflava, subflava, о которых сообщалось в других молекулярных анализах 5;8.

В качестве типа образцов используется эндоцервикальный тампон у женщин и моча первой струи у мужчин. Отметим, что у мужчин тестирование образцов мочи показывает очень хорошую чувствительность и специфичность, представляя неинвазивную альтернативу анализу образцов уретры 10.

Рекомендации по определению Chlamydia trachomatis DNA-диагностика острых урогенитальных инфекций, скрининг инфекции у лиц с высоким риском; скрининг беременных в первом триместре беременности( для беременных ≤ 25 лет и для беременных с высоким риском КТ и НГ тестирование также будет повторяться в третьем триместре; в случае беременных, у которых положительный результат был достигнут в первом триместре, тестирование будет повторяться через 3-6 месяцев)3;6.

Собранный образец – будут собраны образцы из мочеполового тракта: эндоцервикальный мазок для женщин и моча первая струя для мужчин; для женщин будут использоваться тампоны, включенные в лабораторные системы сбора урожая (см. Рисунок 1).

Сбор эндоцервикального образца

Перед забором анализа лишняя слизь будет удалена из шейки матки с помощью одного из двух тампонов, входящих в комплект; затем другой тампон будет вставлен в цервикальный канал, осторожно повернут 5 раз в одном направлении, после чего он будет легко извлечен, избегая контакта со слизистой оболочкой влагалища и вставлен в транспортировочную трубку; он надломит тампон справа от метки, так что только конец тампона останется в транспортной трубке, плотно закрывающейся крышкой. Трубка будет правильно помечена и отправлена в лабораторию.

Рис. 1 система сбора эндоцервикального образца

Стабильность образца - 3 месяца при температуре 2 - 30ºC для эндоцервикальных образцов и для стабилизированных (перенесенных в пробирку)образцов мочи 5.

Метод-ПЦР в реальном времени; используются следующие типы элементов управления: Внутренний контроль КТ/НГ, отрицательный контроль и положительный контроль3.

Значения

Хламидия трахоматис (КТ) необнаружимая ДНК.

Neisseria gonorrhoeae (NG) НЕОБНАРУЖИМАЯ ДНК

Неверный результат указывает на ошибку амплификации нуклеиновых кислот, требующую повторного тестирования образца или, в некоторых случаях, повторения урожая 5.

Необнаружимый результат не исключает наличия инфекции, поскольку скорость обнаружения зависит от качества собранного образца, количества микроорганизмов, присутствующих в образце, стадии инфекции, а также от инфекционных штаммов CT/NG.

Присутствие слизи в эндоцервикальных образцах может ингибировать реакцию ПЦР. Также наличие крови в процентах более 5% (v/v) в эндоцервикальных образцах и более 0.35% (v/v) в перенесенных образцах мочи может привести к недействительным или ложноотрицательным результатам.

На прогностическую ценность теста влияет распространенность инфекции в определенной популяции или группе. Таким образом, в группах с повышенной распространенностью заболеваний, передающихся половым путем, повышается положительная прогностическая ценность. Вместо этого в группах с низкой распространенностью этих категорий инфекций положительные результаты должны быть тщательно интерпретированы в общем клиническом контексте пациента, также принимая во внимание возможность наличия ложноположительных результатов.

Установленная производительность для образцов мочи основана на тестировании первой струи мочи. Для других типов образцов мочи производительность не оценивалась.

Тест не обнаруживает варианты C. trachomatis без плазмид, однако они редко встречаются при генитальных инфекциях.

Как правило, тест не рекомендуется для оценки эффективности лечения антибиотиками, поскольку нуклеиновые кислоты в этих патогенах могут сохраняться в течение как минимум 3 недель после окончания терапии. По истечении этого времени повторное тестирование полезно в случае беременных женщин, при подозрении на отсутствие податливости к лечению или повторное заражение, а также в случаях, когда симптоматика сохраняется.

Тест не будет использоваться в судебно-медицинской практике (в случаях сексуального насилия), при этом культура клеток является единственным методом, принятым в этих ситуации5.

Библиография

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Obligate Intracellular and Nonculturabile Bacterial Agents. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12^th ed., 2007, 510-524.
2. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Chlamydial, Rickettsial, and Mycoplasmal infections. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods– Sauders Elsevier 21-Ed 2007- pg 1002, 1003.
3. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines 2010,” MMWR Recomm Rep, 2013, vol. 59(RR12):1-116.
4. Bernard M. Karnath. Manifestations of Gonorrhea and Chlamydial In Hospital Physician May/June 2009. www.turner-white.com.
5. Laborator Synevo. Referinţe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2013. Ref Type: Catalog.
6. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
7. Specialty Laboratories. Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae for symptomatic and asymptomatic patients. specialtylabs.com. Ref Type: Internet Communication.
8. Rebecca Rockett, Namraj Goire et al. Evaluation of the cobas 4800 CT/NG test for detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Sex Transm Infect 2010;86:470-
9. Barbara Van Der Pol,a,b Oliver Liesenfeld, et al. Performance of the cobas CT/NG Test Compared to the Aptima AC2 and Viper CTQ/GCQ Assays for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Journal of Clinical Microbiology, 2012, vol. 50, No.7, p. 2244-2249.
10. Taylor SN, Liesenfeld O, et al. Evaluation of the Roche Cobas CT/NG test for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male urine. In Sex Transm Dis. 2012, 39(7): 543-9.