Электрофорез белков сыворотки крови с иммунофиксацией

Общая информация

Классически обнаружение и идентификация моноклональных гамопатий осуществляется путем электрофореза белков с иммунофиксацией (IFE), который сочетает электрофоретическое разделение белков агарозного геля с иммунопреципитацией с использованием моноспецифических антисывороток по сравнению с отдельными тяжелыми и легкими цепями. Таким образом, получаются быстрые результаты, которые легко интерпретировать. В то время как появление поликлональных компонентов связано с активностью нескольких типов клонов В-лимфоцитов, моноклональные гамапатии возникают в результате пролиферации одного клона в-клеток.

Капиллярный электрофорез представляет собой альтернативный метод характеристики моноклональных гамопатий (иммунотипия). Каждый образец смешивается с отдельными антисыворотками, специфичными для тяжелых гамма-цепей (Ig G), Альфа (Ig A) и miu (Ig M), а именно с легкими цепями капа (свободными и связанными) и лямбда (свободными и связанными). Белки, разделенные на кварцевые капилляры, обнаруживаются непосредственно поглощением при 200 Нм. Электрофореграммы визуально оцениваются для выявления наличия специфических реакций с предполагаемыми моноклональными белками.

В лабораториях Synevo используются оба автоматизированных электрофоретических метода.1.

Рекомендации по проведению IFE-оценка моноклональных компонентов, обнаруженных при электрофорезе сывороточных белков; оценка амилоидоза, лимфопролиферативных заболеваний, коллагенозов, состояний, связанных с иммунодефицитом или дисгамаглобулинемии2; 3.

Подготовка пациента-à jeun (натощак) или после еды 1.

Собранный образец-а) венозная кровь1; б) моча из 24 часов1.

Контейнер для сбора материала-а) вакуум без антикоагулянта с/без сепараторного геля 2; б) пробирка для мочеиспускания1.

Необходимая обработка после уборки материала 1 Отделите сыворотку центрифугированием.

а) для электрофореза сывороточных белков в агарозном геле с иммунофиксацией, в зависимости от процента полосы, возникающей при электрофорезе сывороточных белков в γ-домене, или реже β, из образцов сыворотки делаются определенные разведения, а именно:

б) в случае капиллярного электрофореза сывороточных белков с иммунотипизацией для каждого образца для анализа и в соответствии с общей концентрацией иммуноглобулинов будет выбрана программа разведения, которая будет автоматически применяться анализатором :

"ГИПЕРГАММА", если общий уровень иммуноглобулинов > 2 г / дл (гипергамаглобулинемия),
"ГИПОГАММА", если общий уровень иммуноглобулинов < 0,8 г/дл (гипогамаглобулинемия),
"Стандарт", если общий уровень иммуноглобулинов составляет от 0,8 до 2 г/дл (график разведения по умолчанию).

в) моча мочится как таковая, предварительно концентрируясь в специальных приспособлениях. Для характеристики легких цепей используется только электрофорез в агарозном геле с иммунофиксацией.

Объем образца-а) мин. 1 мл сыворотки; б) образец 10 мл1.

Причины отторжения образца-гемолизированная сыворотка1.

Стабильность образца-а) отдельная сыворотка стабильна максимум 4 дня при комнатной температуре и 2 недели при 2-8°С2; б) моча стабильна 1 месяц при 2-8°С1.

Принцип метода

а) электрофорез сывороточных/мочевых белков в агарозном геле с иммунофиксацией основан на гелевой визуализации полос, соответствующих специфическим белкам, путем образования комплекса антиген-антитело, после разделения фракций электрофорезом.

Полосы IFE изготовлены из агарового геля и имеют шесть “ножек”: первый выделяется общим белкам, которые разделяются после электрофоретической миграции, остальные обрабатываются антисывающими веществами, которые специфически связываются с иммуноглобулинами человека IgG, IgA, IgM – тяжелые цепи, и k, λ – легкие цепи.

б) капиллярный электрофорез сывороточных белков с иммунотипизацией основан на разделении электрически заряженных белковых молекул в соответствии с их собственной электрофоретической подвижностью в растворе щелочного буфера. Разделение также происходит в зависимости от pH электролитического раствора и электроосмотического потока. Электрофоретическая система состоит из 8 капиллярных трубок, которые работают параллельно. В этой системе готовят разбавленный образец, который одновременно вводят путем аспирации в шесть капилляров на анодном конце. Для иммунотипирования эталонный паттерн (паттерн ELP) получают путем инъекции образца, смешанного с раствором EL, в капилляр № 1. 1, что приводит к полному электрофоретическому паттерну белков в образце. Образцы антисыворотки получают путем инъекции в капилляры № 1. 2-6 образцов, ранее разбавленных и смешанных с антисыворотками, специфичными для тяжелых цепей гамма (Ig G), Альфа (Ig A), miu (Ig M) и легких свободных и связанных цепей Капа и лямбда. Затем происходит разделение белков при высоком напряжении, и прямое обнаружение белков выполняется при 200 Нм на катодном конце капилляра. Капилляры сразу промывают промывочным раствором и подготавливают к следующему анализу с буферным раствором. Наложение паттернов антисыворотки на паттерн ELP позволяет визуализировать исчезновение и / или уменьшение моноклональной фракции на паттерне антисыворотки, что указывает на гамапатию1.

Тесты и чтение результатов

Нормальные образцы сыворотки / мочи не содержат моноклонального компонента.

а) электрофорез сывороточных/мочевых белков в агарозном геле с иммунофиксацией

Моноклональный компонент производит на геле отчетливо узкую полосу-типичную для моноклональной гампатии – в то время как поликлональные иммуноглобулины образуют диффузную “зону” осаждения со специфическими антисыворотками.

В случае олигоклональных гамапатий получается не менее трех узких полос (дискретная полоса, соответствующая тяжелой цепи, и две полосы, соответствующие обоим типам легких цепей)5.

Сравнивается расположение иммунофиксированных полос с эталонной полосой на” ножке", соответствующей общему белку, с возможностью идентификации конкретного белка.

б) капиллярный электрофорез сывороточных белков с иммунотипизацией

В конце анализа каждый шаблон антисыворотки (Ig G, Ig A, Ig M, Kapa и Lambda) автоматически накладывается на шаблон ELP. Если моноклональный компонент и конкретный антисыворотка вступили в реакцию друг с другом, соответствующая фракция исчезает с рисунка антисыворотки. Анализ образца сыворотки, разведенного в разбавителе антисыворотки, проводится во время иммунотипирования и обеспечивает электрофоретический паттерн необработанных белков образца (паттерн “Ref”), что позволяет проверить соответствие между анализом белка и иммунотипизацией. Эти сравнения позволяют идентифицировать и охарактеризовать моноклональные компоненты.

Необработанный паттерн белка (паттерн” Ref") не перекрывается и не может быть наложен на какой-либо антисыворотный паттерн иммунотипизации1.

Нормальный образец сыворотки или образец с гипергамаглобулинемией показывают исчезновение поликлональных иммуноглобулинов на паттернах антисыворотки (рассматриваемых как уменьшение гамма-и/или бета-фракций) без какого-либо влияния на другие фракции белка.
Присутствие моноклонального белка (моноклональная гамопатия) характеризуется исчезновением фракции с одним из антисывороток тяжелых цепей (гамма, Альфа или miu) и либо антисывороткой легкой цепи анти-капа, либо антисывороткой легкой цепи анти-лямбда. Обнаруженный моноклональный наконечник, обычно острый и хорошо разграниченный, должен располагаться на том же расстоянии миграции, что и предполагаемая моноклональная доля, наблюдаемая на эталонной дорожке (дорожка ELP).
Отсутствие реакции с любым из нанесенных антисывороток против цепей и реакция с одним из антисывороток легких цепей могут указывать на :
- легкая цепная гамопатия: результат будет подтвержден антисыворотками со слабо свободной цепью анти-Капа или анти-лямбда при электрофорезе в агарозном геле.
- гамопатия Ig D или Ig встречается очень редко.
Если положительная реакция не наблюдается ни с одним из применяемых легких анти-цепных антисывороток, в то время как тяжелый анти-цепной антисыворотка реагирует, это может указывать на очень редкую гамопатию с тяжелой цепью (гамма, Альфа или miu).
Биклональная гаммопатия характеризуется исчезновением двух фракций тяжелых цепей (одинаковых или разных) и двух фракций легких цепей (одинаковых или разных).
Олигоклональная гамопатия характеризуется исчезновением множества, обычно небольших, пиков или отклонений с одним или несколькими типами тяжелых цепей и двумя типами легких цепей

Предел обнаружения моноклонального компонента составляет около 25 мг /дл (при капиллярном электрофорезе сывороточных белков с иммунотипией)1.

Клиническая интерпретация результатов

Присутствие моноклонального белка в сыворотке или моче обычно указывает на злокачественный процесс, хотя моноклональные компоненты также могут возникать при различных доброкачественных состояниях или даже при отсутствии патологических изменений (моноклональная гаммопатия неопределенного значения, требующая периодического мониторинга для проверки стабильности моноклонального компонента).

При множественной миеломе 99% пациентов имеют моноклональный белок в сыворотке или моче.

Болезнь Вальденстрема характеризуется обязательным присутствием в сыворотке моноклонального белка IgM-типа.

Примерно у 75% пациентов с множественной миеломой или болезнью Вальденстрема в моче обнаруживается легкая моноклональная цепь (белок Бенса-Джонса).

В моче пациентов с множественной миеломой или амилоидозом могут быть обнаружены как фрагменты тяжелых цепей, так и свободные легкие цепи4.

При болезни тяжелых цепей моноклональная полоса получается рядом с тяжелой цепью без соответствующей полосы, расположенной рядом с легкой цепью5.

Границы и помехи

Этот тест не включает моноспецифические антисыворотки для IgD и IgE. В случае клинического подозрения на множественную миелому типа IgD или IgE рекомендуется Иммунофиксационный тест IgD, IgE.

Реакция антиген-антитело отличается между жидкой фазой и агарозой. Поскольку капиллярный электрофорез полностью выполняется в жидкой среде, некоторые антисыворотки иногда могут перекрестно реагировать с моноклональными компонентами, присутствующими в образце. Эта перекрестная реакция, которая происходит очень редко, может привести к выводу, что биклональная гамопатия присутствует вместо реальной моноклональной гамопатии. Обращение к электрофорезу в агарозном геле обеспечивает выяснение таких ситуаций 1.

Библиография

1. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog
2. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Immunofixation (IFE), Serum and Protein Electrophoresis, Serum. www.labcorp.com . 2015. Ref Type: Internet Communication
3. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Immunofixation (IFE)   and    Protein Electrophoresis, 24H-Urine.. www.labcorp.com . 2015. Ref Type: Internet Communication.
4. Frances Fischbach. Immunodiagnostic Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 613-614.
5. Lothar Thomas. Monoclonal Immunoglobulins. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 746.