Количественная серология сифилиса (реагин + аллерген-специфические антитела)

Тест содержит количественные RPR и количественные антитела Treponema Pallidum.

Общая информация

Сифилис-это инфекционное и заразное заболевание, определяемое Treponema pallidum, патогенной спирохетой, которая передается половым путем или трансплацентарным путем, за исключением контакта с кровью (жало, переливание)4

a. Клиническая картина

После контакта возбудитель быстро проникает через лимфатическую систему. Инкубационный период составляет от 15 дней до 3 месяцев. При отсутствии интеркурентной антибиотикотерапии, которая “обезглавливает " сифилис, заболевание постепенно оседает и может привести к различным клиническим проявлениям, классифицируемым следующим образом: ранний (инфекционный) сифилис и поздний (неинфекционный) сифилис. Каждая из 2 стадий может включать следующие клинические формы (см. таблицу 1):

- первичный, вторичный сифилис и ранний латентный сифилис (при раннем сифилисе);

- поздний латентный сифилис и многочисленные формы третичного сифилиса (при позднем сифилисе)2;3.

Первичный сифилис - первая стадия сифилиса, возникающая после заражения бледной трепонемой и начинающаяся с кожных проявлений в месте ее внедрения. Характеризуется появлением твердого шанкра (первичной сифиломы) на коже или слизистой с последующим развитием регионарного лимфангита и лимфаденита.

Вторичный сифилис — следующий за первичным период развития сифилиса, который характеризуется диссеминированной (широко распространенной) сыпью с большим разнообразием элементов (розеолами, папулами, везикулами, пустулами), поражением внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы и генерализованным лимфаденитом (воспалением лимфоузлов).

Ранний латентный (скрытый) период заболевания характеризуется отсутствием каких-либо клинических проявлений, кроме положительного результата лабораторных анализов. Его развитие возможно от начала заражения до перехода во вторую стадию. В это время у больного могут возникнуть активные проявления возбудителя, которые оказываются заразными для окружающих. Поздний — определяется спустя 2 года и более, а также неуточненный.

Третичный сифилис — третий период сифилиса, развивающийся у недостаточно пролеченных пациентов или больных, вообще не проходивших лечение. Проявляется образованием сифилитических инфильтратов (гранулем) в коже, слизистых, костях и внутренних органах.

Врожденным называется сифилис, который передается будущему ребенку трансплацентарно через кровь матери. Врожденный сифилис бывает ранним и поздним. К раннему врожденному сифилису относятся сифилис плода, сифилис грудного возраста и сифилис раннего детского возраста.

Ранний латентный (скрытый) (Инфекционный)
Продолжительность воздействия	Клиническая картина
9-90 дней	Первичный сифилис
6 недель.-6 месяцев (4-8 недель. после проникновения трепонем)	Вторичный сифилис
≤ 2 лет	Ранний латентный
Третичный сифилис (неинфекционный)
> 2 года	третичный латентный сифилис
3-20 лет	Третичный сифилис (гоматос, сердечно-сосудистый, нейросифилис)
ВРОЖДЕННЫЙ СИФИЛИС
< 2 года после рожденич (включая рождение мертвого плода)	Ранний врожденный сифилис
≥ 2 лет	Поздний врожденный сифилис
Примечание: трансплацентарная передача происходит на ранней стадии сифилиса; но были описаны случаи и на поздней стадии латентного сифилиса

b. Биологический аспекты. Обычная диагностика сифилиса основана на серологических методах, доступных в большинстве лабораторий. Прямые методы (микроскопия темного фона, иммунофлуоресценция, инокуляция у животных) остаются прерогативой специализированных лабораторий.

Иммунный ответ против инфекции включает выработку антител по сравнению с широкой палитрой антигенов, включая как неспецифические антитела (антикардиолипин/реагин), так и антитрепонемические специфические антитела. Первый очевидный ответ представлен специфическими антитрепонемическими антителами типа IgM, которые могут быть обнаружены в конце 2-й недели инфекции; антитрепонемические антитела типа IgG появляются позже, на четвертой неделе. Таким образом, в начале клинической симптоматики у большинства пациентов наблюдаются антитела IgM и IgG (см. рис.1).1).

Неспецифические антитела срабатывают примерно через 4 недели после инфекционного контакта. Лечение и связанная с этим ВИЧ-инфекция могут повлиять на иммунный ответ.

Титр неспецифических антител и титр IgM-специфических антител быстро уменьшается после соответствующего лечения при раннем сифилисе, но IgG-специфические антитела сохраняются неопределенно 3.

Принимая во внимание особенности иммунного ответа, серологические тесты на сифилис можно разделить на 2 обширные категории:

• Тесты, которые выделяют неспецифические антитела (не трепонемические тесты):
  • VDRL – Venereal Disease Research Laboratory si
  • RPR – Rapid Plasma Reagin test
• Тесты, которые выделяют специфические антитела (трепонемические тесты):
  • TPHA – Treponema pallidum Haemagglutination Assay – (пассивная гемагглютинация-обнаружение общих антител IgG и IgM),
  • FTA – ABS (Fluorescent Treponemal Antibody – Absorbtion de tip IgG si IgM),
  • EIA (de tip IgG si IgM)^1;3;4

Нетпрепонемические тесты быстрые, простые в выполнении, имеют низкую стоимость и демонстрируют очень хорошую чувствительность, особенно на ранней стадии инфекции. Их главный недостаток заключается в том, что они связаны с важным уровнем ложноположительных результатов, особенно у беременных женщин (в этой категории около 28% положительных результатов для RPR могут быть биологически ложноположительными). Результаты могут быть выражены качественно или полуколичественно; титры VDRL/RPR повышены у пациентов с острой инфекцией, реинфекцией или реактивацией инфекции в анамнезе, которая не лечилась должным образом. Приблизительно у 72-84% пациентов с первичным или вторичным сифилисом наблюдается 4-кратное снижение титра VDRL/RPR через 6 месяцев после завершения правильного лечения. Частота серореверсии зависит от титра перед лечением и стадии заболевания. Люди, которые показывают первый эпизод инфекции, имеют более высокие шансы серореверсии, чем люди с повторными инфекциями. Таким образом, нетпрепонемические тесты полезны не только для выявления инфекции, но и для мониторинга эффективности лечения.

Трепонемические тесты используются для подтверждения положительных скрининговых тестов. У них более низкая частота ложноположительных результатов, чем у реагиновых тестов. Они обычно не рекомендуются для скрининга инфекции, потому что они имеют более низкую чувствительность, чем не-трепонемические тесты в течение первых 2-3 недель первичной стадии сифилиса. Этот тип антител сохраняется всю жизнь; они не полезны для мониторинга терапевтической эффективности.

Иммуноферментные тесты EIA с использованием рекомбинантных трепонемных антигенов в лунных бляшках для обнаружения антител IgG и IgM имеют сходную чувствительность к не-трепонемным тестам и эквивалентную специфичность тестов TPHA и FTA-ABS. По этим причинам тесты EIA могут представлять собой эффективную альтернативу традиционной ассоциации непрепонемических и трепонемических тестов для окончательного диагноза сифилиса. Тесты EIA IgM более чувствительны, чем FTA-ABS IgM, и могут использоваться для диагностики раннего или врожденного сифилиса 3.

Врожденный сифилис. При рождении новорожденный имеет тот же серологический профиль, что и у матери, из которой был сделан пассивный перенос IgG, и который исчезнет в первые 3-6 месяцев у неинфицированного ребенка. Серологический контроль неинфицированного ребенка проводится с целью последующего постепенного снижения титра антител. Для инфицированного и пролеченного ребенка антитрепонемические антитела сохраняются в течение длительного времени, и только значительное снижение VDRL позволяет отслеживать эффективность лечения. Дозирование IgM у новорожденного делает различие между пассивным проходом материнских антител (IgG) и активным синтезом IgM новорожденным. Серологический профиль с отрицательным IgM не исключает диагноза врожденного сифилиса, если мать была инфицирована поздно во время беременности 3;7.

Серодиагностика беременных

Как упоминалось выше, не-трепонемические тесты связаны со значительным уровнем ложноположительных результатов, особенно при наличии низких титров. "Поэтому в районах с высокой распространенностью инфекции, где доступ к подтверждающим тестам ограничен, беременные женщины с титром ≥ 8 должны обязательно получить лечение". Тем не менее, учитывая заболеваемость и смертность, связанные с врожденной инфекцией, и отсутствие доступа во многих областях к количественным тестам RPR, рекомендуется немедленно лечить всех беременных женщин, которые показывают положительный результат не-трепонемических или трепонемических тестов. Риски, связанные с нелеченным сифилисом во время беременности, намного перевешивают риск ненужного лечения у матерей с ложноположительным исходом7.

Сифилис и ВИЧ-инфекция у большинства ВИЧ - позитивных пациентов серологический ответ на инфекцию Treponema pallidum неизменен. Редкие случаи, когда сообщалось о негативных или слабо положительных реакциях для пациента с вторичным сифилисом 5.

Рекомендации по определению серологии сифилиса

При наличии признаков и симптомов инфекции Treponema pallidum или других заболеваний, передающихся половым путем:

1. Пренатальный скрининг-тест (в I, III триместре и при рождении)
2. Добрачный скрининг-тест
3. Тестовый скрининг при приеме на работу, страхование жизни и т. д.
4. Скрининг-тест для доноров крови и органов
5. Выявление или исключение инфекции у ВИЧ-позитивных пациентов
6. Мониторинг реакции на лечение (количественный RPR)3

Подготовка пациента-à jeun (натощак)6.

Собранный образец-венозная кровь 6.

Контейнер для сбора материала-vacutainer без антикоагулянта с / без сепараторного геля 6.

Необходимая обработка после сбора материала – отделите сыворотку центрифугированием; определение выполняется немедленно; если это невозможно, сыворотка хранится при 2-8ºc6.

Объем образца-минимум 1 мл сыворотки6.

Причины отторжения образца-гемолизированный, липемический или бактериально загрязненный Образец 6.

Стабильность образца-отдельная сыворотка стабильна: 7 дней при 2-8°C и длительное время при – 20°C6.

Метод работы

Можно использовать две категории методов работы:

I. классические методы

VDRL: липосомы в суспензии вызывают заметную реакцию флокуляции в присутствии реагинов в сыворотке пациента.

RPR  Модифицированный антиген VDRL содержит микрочастицы углерода, которые агрегируют в присутствии антител типа рейгина из сыворотки пациента
Качественная и полуколичественная реакция
Он обнаруживает неспецифические антитела к инфекции Treponema pallidum, продуцируемые как реакция на липоидный материал, высвобождаемый из пораженных клеток хозяина, и липопротеиновый материал, высвобождаемый спирохетами.

TPHA:
Пассивная реакция гемагглютинации между стабилизированными и сенсибилизированными куриными эритроцитами с антигенным экстрактом Treponema pallidum (штамм Nichols) и антитрепонемическими антителами, присутствующими в сыворотке больного
Качественная и количественная реакция
Выявляет специфические антитела к инфекции Treponema pallidum3;6.

II. АВТОМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

A. RPR (ИММУНОТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ метод)

● Частицы латексного полистирола, покрытые липидными антигенами ( кардиолипин и лецитин), реагируют с антителами реагинового типа в сыворотке пациента, образующими агглютинаты; агглютинареиндуцирует увеличение мутности реакционной смеси, которое можно измерить как поглощение при 700 Нм с помощью фотометра; титр реагинов можно определить, измеряя мутность в два разных момента после начала реакции.

● Количественная реакция .

B. общие антитела против TREPONEMA PALLIDUM (иммунохимический метод с ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ обнаружением-ECLIA)

● На первом этапе сыворотка пациента инкубируется с биотинилированными рекомбинантными антигенами, специфичными для Treponema pallidum, и с рекомбинантными антигенами, специфичными для Treponema pallidum, меченными комплексом рутения, что приводит к „сэндвич-комплексу”; после добавления микрочастиц, покрытых стрептавидином, комплекс будет связываться с твердой фазой в результате взаимодействия стрептавидин-биотин; реакционная смесь будет всасываться в измерительную клетку, где микрочастицы будут магнитно захватываться на поверхность. электрода; применение напряжения к электроду будет генерировать хемилюминесцентный сигнал, который будет измеряться фотоумножителем; результат будет автоматически определен путем сравнения электрохимилюминесцентного сигнала, полученного продуктом реакции образца, с сигналом значения отсечения, ранее полученным путем калибровки

● Полуколичественная реакция .

Ссылочные значения и выражение результата

I. классические методы

A. Для VDRL/RPR:

отрицательный (-)
положительный (от + до++++)

Если будет проведен полуколичественный тест, он будет сообщаться вместе с интенсивностью реакции и титром, соответствующим последнему разведению, которое показало положительный результат.

B. Для TPHA:

отрицательный (-)
двусмысленный
положительный (от + до++++).

II. АВТОМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

A. Для RPR

● результат выражен в R. U. (единицы RPR); 1 R. U. соответствует титру RPR 1/1 к классической реакции.

● отрицательный: <1 R. U.

● предел обнаружения: 0.4 R. U.

В случае получения положительного результата анализатор автоматически повторяет определения с использованием стандартного разведения 1/8. В ситуации, когда титр антител очень высок, проводят ручные разведения.

B. Для антител против Treponema pallidum

● результат выражается в форме индекса.

● отрицательный: <1; положительный: ≥1.

Положительный результат любого из двух тестов также проверяется классическим методом; если используется только классический метод, положительный результат будет подтвержден вторым набором реагентов. Если будут получены противоречивые результаты, будет предложено повторить сбор пробы6.

Интерпретация результатов

Диагностический алгоритм. Простой алгоритм диагностики сифилиса выполняется, начиная с VDRL и TPHA. (тесты, которые проводятся в лабораториях Synevo)

VDRL = отрицательный; TPHA = отрицательный

- отрицательная серология

- результат не исключает диагноза сифилиса в начале; в случае клинического подозрения рекомендуется повторить серологию в течение 2 недель или выполнить FTA-ABS IgM или EIA IgM, которые могут быть положительными на ранней стадии.

VDRL = отрицательный; TPHA = положительный

- лечение старой инфекции

- возможно, это все еще может быть сифилис на очень ранней стадии: в случае клинического подозрения рекомендуется повторить серологию в течение 2 недель или выполнить FTA-ABS IgM или EIA IgM;

-другие возможности: ложноположительная реакция на TPHA, поздний латентный сифилис, при котором иногда бывает трудно поставить диагноз, реакции, инкрустированные не венерическими трепонематозами (Piano, bejel, pinta) у пациентов, происходящих из эндемичных районов.

VDRL = положительный; TPHA = положительный

- недавний или старый сифилис, без лечения или позднего лечения

Примечание: при первичном сифилисе значения слабо положительны, во вторичном титр антител повышен. При отсутствии клинических признаков пограничный уровень антител затрудняет серологическую интерпретацию. Возникает вопрос о раннем латентном сифилисе или лечении антибиотиками, которым следует пациент. У пациентов с поздним лечением серология может оставаться положительной, но отслеживание динамики титра антител со значительным уменьшением VDRL помогает установить диагноз.

VDRL = положительный; TPHA = отрицательный

-в случае интенсивно положительного VDRL это, скорее всего, ложноположительный биологический результат (часто возникает вопрос о существовании антикардиолипиновых антител); в любом случае рекомендуется повторение серологии через 2-3 недели (возможно, количественные определения в динамике)

- в случае слабо положительного VDRL рекомендуется проводить FTA-ABS; если этот тест отрицательный, это ложноположительный биологический результат; если тест положительный, это может быть ранний сифилис, и в этом случае рекомендуется повторить серологию в течение 2-3 недель (серологический профиль, наиболее часто встречающийся при первичном сифилисе, - VDRL +, TPHA+; очень редко, на ранних стадиях первичного сифилиса, TPHA отрицательный,FTA-ABS положительный) 8; 9.

Границы и помехи

A. Для VDRL:

Ложноположительные реакции:

Бактериальные инфекции: пневмококковая пневмония, скарлатина, проказа, рецидивирующая лихорадка, бактериальный эндокардит, малярия, риккетсиоз, пситтакоз, лептоспироз, мягкий шанкр, туберкулез, микоплазменная пневмония, трипаносомоз.

Вирусные инфекции: оспа, ветряная оспа, корь, инфекционный мононуклеоз, эпидемический паротит, вирусный гепатит, СПИД.

Неинфекционные причины: беременность, хронические заболевания печени, запущенные новообразования, множественная миелома, заболевания коллагеновой ткани, множественные переливания крови, пожилой возраст.

Сильно липемические (лактесцентные) сыворотки могут влиять на тест.

B. Для TPHA:

Ложноположительные реакции:

Инфекционный мононуклеоз, волчанка, проказа, малярия, рецидивирующая лихорадка, лептоспироз
Аномальный уровень Ig G или Ig M
Невенерные трепонематозы: фортепиано, бежель, Пинта

Сильно липемические (лактесцентные) сыворотки могут влиять на тест.

Для положительных или двусмысленных сывороток рекомендуется проводить реакцию FTA-ABS, которая позволяет дифференцировать антитела IgM от антител IgG1;3; 6.

В случае определения антител против Treponema pallidum с помощью ECLIA они могут создавать помехи некоторым компонентам комплекта и приводить к неубедительным результатам следующие:

- лечение биотином в высоких дозах (>5 мг/день); поэтому рекомендуется, чтобы сбор крови производился как минимум через 8 часов после последнего приема;

- сильно повышенные титры антител против стрептавидина и против рутения 6.

 Библиография

1. Dieusaert Pascal, Guide Practique des Analyses Médicales, Éditions Maloine, 2002, 973-977

2. Dupin N., Syphilis- Aspects cliniques, BEH 2001, 35-36: 170-172

3. Egglestone SI, Turner AJL. Serological diagnosis of syphilis. In Commun Dos. Public Health 2000, 3: 158-62.

4. Harrison. Sifilisul. In Principiile medicinei interne, Editia a 13-a, vol.I, Ed.Teora, 1998, 809-821

5. Janier M., Chasrang C., Spindler E. et al. A prospective study of the influence of HIV status on the seroconversion of serological tests for syphilis. In Dermatology, 1999; 198: 362-369.

6. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog

7. Rosanna W. Peeling et.al. Maternal and Congenital Syphilis. In Bulletin of the World Health Organization, June 2004, 82 (6)

8. Results Interpretation for Syphilis Serology. University Hygienic Laboratory. Communication www.esculape.com/fmc/syphilis.html Ref Type: Internet