Fagotest (activitate fagocitară neutrofile)

Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului

Neutrofilele deţin un rol important în răspunsul imun nespecific, în special în rezistenţa antibacteriană, ca celule efectoare, inductoare şi reglatoare. Printre caracteristicile lor esenţiale se numără:

Fagocitoza este mediată de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele având receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 şi pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite şi opsonizate sunt distruse atât prin mecanisme oxigen-dependente cât şi oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradează bacteriile absorbite în fagozomi şi sunt parţial eliberaţi în mediul inconjurător unde intensifică distrugerea microorganismelor şi determină simultan lezarea ţesuturilor. Procesul este caracteristic inflamaţiei acute, fiind mult mai rar întâlnit în afecţiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce şi prin intermediul proteinelor prezente în granulaţiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamaţiei, citokinele (de exemplu, TNFα) şi selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamaţie. Capacitatea de fagocitoză este crescută prin intensificarea producţiei de radicali de oxigen şi prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenţează activitatea fagocitară şi citotoxică a neutrofilelor. La rândul lor, granulocitele activate secretă citokine; IL-1 care stimulează producţia de IL-8 de către monocite, celule endoteliale şi fibroblaşti, creşte expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 şi generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokină puternică care intensifică expresia receptorului Fc, stimulează modificările oxigenului precum şi eliberarea granulelor din neutrofile¹.

Datorită caracteristicilor menţionate granulocitele sunt implicate în răspunsul inflamator precoce, iar anomaliile funcţionale ale acestora, survenite în oricare din etape, determină deficienţe semnificative ale imunităţii celulare⁵.

Fagocitoza anormală poate să apară în cazul unor defecte ale neutrofilului, ale imunoglobulinelor sau ale complementului. Cele mai cunoscute defecte moştenite sunt:

• disfuncţia actinei din neutrofile (NAD): tulburare de motilitate a neutrofilelor indusă genetic ce determină reducerea marcată a capacităţii de migrare şi de ingerare a particulelor;
• deficienţa de tuftsina; tuftsina fiind implicată în stimularea fagocitozei, deficitul acesteia se asociază cu perturbarea fagocitozei şi susceptibilitate crescută faţă de infecţii (germenii cel mai frecvent implicaţi: Staphylococus aureus, Streptococcus pneumoniae, Candida spp.); pacienţii prezintă rash-uri asemănătoare dermatitei seboreice, adenopatii fluctuante, infecţii respiratorii⁴;
• defectul receptorului pentru fragmentul complementului iC3b (CD11b) – rezultă dintr-o biosinteză anormală a unui lanţ beta de 95kDa (CD18) care este comun receptorului iC3b şi moleculelor de adeziune LFA-1, Mac-1 şi CR4; anomalia a fost denumită defectul de adeziune leucocitara tip 1 (LAD-1), se transmite autozomal recesiv şi se caracterizează clinic prin ulcere cutanate cronice/recurente, gingivită, fistule intestinale sau perianale; funcţiile leucocitare (marginaţia, chemotactismul, opsonizarea mediată prin iC3b şi fagocitoză) sunt sever afectate².

Pregătire pacient – se va evita recoltarea probei în cursul unei infecţii acute³.

Specimen recoltat – sânge venos³. 

Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu³.

Volum probă – minim 2 mL sânge heparinat³.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei³.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate³.

Metodă – citometrie în flux.

Fagotest permite evaluarea cantitativă a fagocitozei prin măsurarea procentului de fagocite care au ingerat bacterii şi a activităţii acestora (număr de bacterii/celulă). Se utilizează bacterii (E. coli) opsonizate marcate cu fluoresceină (FITC-E. coli) care se incubează împreună cu sângele pacientului la 37°C; se utilizează şi o probă cu rol de control negativ care se menţine pe gheaţă; ulterior, fagocitoza este oprită prin plasarea probelor pe gheaţă şi adăugarea soluţiei de stopare; această soluţie permite diferenţierea între ataşarea şi internalizarea bacteriilor prin eliminarea fluorescenţei bacteriilor legate de suprafaţa celulelor şi menţinând nealterată fluorescenţa particulelor internalizate; după două etape de spălare se îndepărtează eritrocitele cu ajutorul soluţiei de liză; soluţia de colorare a ADN-ului, adaugată înaintea analizei prin citometrie în flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietăţi de dispersare a luminii asemănătoare leucocitelor; se utilizează un laser cu argon (488 nm, lumina albastră); pentru fiecare probă se colectează prin “gating”  10000-15000 leucocite; sunt analizate atât procentul de celule (neutrofile şi monocite) care au fagocitat bacterii, cât şi intensitatea medie a fluorescenţei acestora (numărul de bacterii ingerate); în acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant şi se va analiza histograma fluorescenţei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenţa-1 (FL1), astfel încât sub 1% din evenimente să fie pozitive; procentul de celule care fagocitează bacterii va putea fi apoi determinat prin numărarea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescenţei se corelează cu numărul de bacterii ingerate de către un singur leucocit³.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Sunt raportaţi următorii parametri:

• Procentul de neutrofile care fagocitează bacterii: >84%
• Activitate fagocitară neutrofile: >550 mfi; mfi = intenistatea medie a fluorescenţei³.

Bibliografie