Imunofenotipare limfocitară – imunitate tumorală

Informaţii generale

Transformarea neoplazică a unei celule reprezintă prima etapă din istoria naturală a cancerului. Celula tumorală odată apărută determină, prin diviziuni succesive, formarea unei clone celulare şi în final constituirea ţesutului tumoral, cu exprimarea principalelor caracteristici ale fenotipului malign şi anume: proliferarea excesivă şi infinită, migrarea anormală şi instabilitatea genetică¹.

La adult leziunea canceroasă reprezintă, în cele mai multe cazuri, stadiul final al unei inflamaţii cronice (de exemplu, fumatul se asociază cu neoplasmul pulmonar, radiaţiile solare cu cancerul cutanat), pe când la copil este rezultatul unei instabilităţi genomice progresive, înnăscută sau datorată unor leziuni genetice dobândite. Tumorile pediatrice sunt sărace în celule ale imunităţii dobândite (celule T şi celule dendritice mieloide)⁶.

Problema existenţei cu adevărat a imunovigilenţei în cazul tumorilor nu este încă rezolvată. În timp ce în cazul bacteriilor şi a virusurilor, care exprimă o varietate de proteine străine, sistemul imun poate recunoaşte şi controla efectiv infecţia, în cazul celulelor tumorale, care diferă foarte puţin de cele normale, răspunsul imun nu mai are aceeaşi eficienţă².

Antigenele tumorale

În mod ideal, pentru a fi recunoscute ca străine de către sistemul imun, ar trebui ca antigenele tumorale să fie exprimate doar de celulele tumorale, nu şi de cele normale. În realitate majoritatea antigenelor tumorale sunt puţin imunogene, fiind slab exprimate şi foarte heterogene. În acelaşi timp există şi antigene supraexprimate la nivelul celulei tumorale, dar care se găsesc de asemenea în cantităţi mici în celulele normale².

Antigenele tumorale recunoscute de limfocitele efectoare au fost clasificate astfel:

 – antigene străine organismului (specific tumorale): molecule ce sunt expresia unor gene mutante, oncogene virale, molecule ce prezintă modificări post-translaţionale anormale (de exemplu, MUC1– underglycosylated mucin). În cazul acestor proteine mutante, doar cateva peptide pot fi potenţial recunoscute ca străine organismului;

– self-antigene: antigene testiculare, antigene de diferenţiere care se exprimă doar în anumite tipuri de ţesuturi (de exemplu, antigenele de diferenţiere exprimate de melanocite şi celule melanomatoase implicate în producerea de melanină), antigene supraexprimate de celulele tumorale comparativ cu statusul lor normal (de exemplu, – tirozinaza exprimată în mod normal de toate melanocitele apare în concentraţii crescute în celulele melanomatoase); celulele T cu specificitate pentru tirozinază, ce recunosc şi distrug celulele tumorale, pot fi găsite în sângele unor pacienţi cu melanom; aceste celule T sunt responsabile de depigmentarea pielii (vitiligo) la aceşti pacienţi, fapt ce se asociază cu un prognostic bun; – antigenele fetale (AFP şi CEA) prezente în tumori ale ficatului, gonadelor şi în diverse adenocarcinoame se găsesc în cantităţi crescute în timpul dezvoltării fetale, dar sunt puţin exprimate în mod normal la adult; aceste oncogene fetale sunt folosite ca markeri de progresie tumorală; – HER-2/neu , cunoscut ca şi c-Erb-2 (receptor tirozin-kinazic omolog cu receptorul factorului de creştere epidermal). Răspunsul faţă de toate aceste antigene constă în celule efectoare CD4+ şi/sau CD8+^1;2.

Mecanisme de evaziune a apărării imune în cancer

Formaţiunile tumorale au proprietatea de a fi tolerate de sistemul imun prin exprimarea unor factori care influenţează negativ răspunsul imun al organismului.

Există o serie de motive pentru absenţa unui răspuns imun eficace în cazul tumorilor. Fiecare proteină autologă este degradată în citoplasmă până la peptide formate din 9-12 aminoacizi. Aceste peptide sunt transportate de către un sistem numit „tranporter associated with antigen processing (TAP)” la reticulul endoplasmic unde sunt legate de moleculele MCH clasa I şi prezentate celulelor T CD8+².

În cazul tumorilor, peptidele nu  se “potrivesc” mereu la locul de legare pe moleculele MCH clasa I. Existenţa unui mecanism defectuos de procesare a antigenelor la nivelul celulei tumorale (de exemplu, deficitul de TAP) face ca peptidele tumorale să nu fie transportate la nivelul reticulului endoplasmic şi să nu fie prezentate la suprafaţa celulei. În multe cazuri diminuarea moleculelor MCH clasa I şi II pe suprafaţa celulelor tumorale împiedică recunoaşterea acestora de către limfocitele T şi astfel răspunsul imun nu poate fi declanşat^2;6.

Celulele tumorale nu pot fi considerate adevărate celule prezentatoare de antigen, deoarece le lipsesc molecule co-stimulatoare importante, CD80 şi CD86, necesare pentru activarea celulelor T. În absenţa co-stimulării, prezentarea peptidelor via complex MCH/TCR, duce la anergia celulelor T şi toleranţă.

Unele celule tumorale sunt de asemenea capabile de a stopa producerea de antigene tumorale evitând astfel răspunsul imun. De asemenea tumorile pot produce substanţe imunosupresive aşa cum sunt IL-10, TGFβ (transforming growth factor beta), prostaglandine, iar în unele cazuri  celulele tumorale pot exprima molecule MCH I-like ce interacţionează cu liganzii inhibitori aflaţi pe celulele T, ducând în final la anergia/apoptoza celulelor T².

Asemănător virusurilor (HIV, HCV), tumorile solide sunt caracterizate prin instabilitate genomică ceea ce conduce la generarea unor neoepitopi identificaţi potenţial de moleculele MCH clasa I şi II³.

În ultima decadă s-a observat un interes crescut faţă de  mecanismul dominant de toleranţă mediat de celulele T reglatoare – Tregs (CD4+CD25+), ce par să joace un rol important în autoreactivitate, alergii, infecţii şi transplant, controlând atât răspunsul imun înnăscut cât şi pe cel dobândit, limitând astfel autoimunitatea şi imunopatologia. Selecţia acestor celule are loc în mod natural în timus – natural T regulatory cells (nTreg), dar pot fi induse şi în periferie – induced Treg cells (iTreg). Efectul supresor al celulelor Treg asupra răspunsului imun tumoral este bine documentat. Astfel, studiile efectuate pe şoareci arată că îndepărtarea celulelor Treg favorizează rejetul celulelor tumorale putând chiar să prevină dezvoltarea acestora in vivo, atât la şoarecii „predispuşi la cancer” cât şi după tratamentul cu agenţi chimici. În studiile efectuate pe pacienţii cu cancer s-a observat prezenţa mult mai frecventă a celulelor Treg în populaţia limfocitară periferică decât la persoanele sănătoase. Există, de asemenea rapoarte din care reiese faptul că nivelele crescute de Treg se corelează cu un stadiu avansat al bolii, fiind implicate astfel în progresia cancerului. Infiltrarea cu celule T reglatorii este de asemenea prezentă şi în staţiile ganglionare metastazate, nu şi în cele fără metastaze^1;3.

Mecanisme efectoare ale imunităţii

La adult, răspunsul imun înnăscut are rolul de a recunoaşte celulele “stresate” sau conţinutul celular nedigerat atunci când celulele devin nonapoptotice sau nonautofagocitice.

Răspunsul imun adaptativ (dobândit) joacă un rol crucial, fiind o sursă bogată de celule T efectoare CD4 şi CD8 cu rol în recunoaşterea proteinelor aberante ce apar la nivelul tumorii, în acelaşi timp reprezentând sursa unor celule regulatoare şi a unor factori cu rol important în limitarea abilităţii celulelor NK şi a celulelor T de a media eradicarea cancerului⁶. 

Modul în care diferitele tipuri de celule implicate în generarea răspunsului imun influenţează în sens pozitiv sau negativ creşterea tumorală este prezentat în tabelul următor¹:

Imunofenotipare limfocitară – profil tumoral şi recomandări pentru efectuarea acestui test

În cadrul profilului tumoral sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută următoarele subseturi de limfocite, prin identificarea markerilor de suprafaţă specifici (moleculele CD):

• limfocitele T totale (CD3+);
• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
• celule CD31+ (rezerva timică);
• limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
• celule Treg (CD25++/CD127-);
• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice),  celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
• raport CD4+/CD8+;
• celule  T imature (CD4+/CD8+);
• celule T activate ( CD3+/HLA DR+);
• celule B (CD19+)
• celule NK (CD16+/CD56+) şi NK activate.

Testul este indicat pentru monitorizarea statusului imun la pacienţi cu diverse afecţiuni maligne, mai ales dacă sunt aplicate tratamente de imunostimulare⁴.

În cursul evoluţiei neoplaziilor, se instalează constant un status de imunodeficienţă (ce trebuie urmărit în dinamică) de intensitate diferită în funcţie de tipul tumorii, stadiul procesului malign şi mijloacele de apărare ale organismului⁹.

Celulele T naive CD4+CD31+  reprezintă o subpopulaţie a celulelor T CD4+ naive recent eliberate din timus.

Statusul „CD28” diferenţiază limfocitele CD8 cu proprietăţi citotoxice. Numărul celulelor T citotoxice nu dă informaţii despre funcţia lor, acest lucru fiind posibil prin teste funcţionale (teste de citotoxicitate)⁴.

Celulele T CD8+ pot fi împărţite în funcţie de expresia pe suprafaţa lor a receptorului co-stimulator CD28 în CD28+ (aproximativ 50% din celulele CD8+) şi CD28-, fiecare din cele două populaţii limfocitare având proprietăţi biologice şi secretoare diferite.

Populaţia de celule T CD28+ predomină la indivizii sănătoşi şi proliferează în timpul infecţiilor virale primare.

S-a observat că celulele T reglatorii CD8+ CD28-  sunt prezente aproape constant în infiltratul limfocitar tumoral, fiind un potent factor supresor faţă de răspunsul imun, putând inhiba, prin intermediul IL 10, atât proliferarea celulelor T cât şi citotoxicitatea specifică anti-tumorală^3;8.

Celulele T CD8+ CD28- sunt prezente în procent mai mare în sângele periferic al bolnavilor de cancer decât la voluntarii sănătoşi.

Superfamilia CD28 este formată din molecule receptoare cu acţiune co-stimulatoare (CD28 şi costimulatorul inductibil – ICOS) sau inhibitoare (CTLA-4, PD-1 şi BTLA) asupra celulelor T. CD28 şi CTLA-4 sunt receptori specifici ai celulelor T pe când BTLA şi PD-1 sunt exprimate şi pe celulele B, iar ICOS pe celulele NK.  Activarea sau inhibarea celulelor T ca răspuns la un stimul antigenic necesită două semnale din partea celulelor prezentatoare de antigen (APC). Primul semnal este reprezentat de antigenul exprimat de APC sub forma peptidelor legate de moleculele MCH, care se leagă de TCR. Recunoaşterea antigenului de către receptorii celulei T asigură specificitatea răspunsului. Al doilea semnal, co-stimulator sau inhibitor, este asigurat de interacţiunea unor anumiţi receptori ai celulelor T cu liganzii corespunzători de la suprafaţa APC. CD28 este considerat prototipul receptorului co-stimulator. Se consideră că CD28 este prezent pe aproape toate celulele T CD4+ şi doar pe jumătate din celulele CD8+. În absenţa co-stimulării semnalele venite de la TCR pot induce anergia celulelor T. În prezenţa celor două semnale are loc producerea de citokine (de ex. IL2) ca şi poliferarea, diferenţierea şi supravieţuirea celulelor T.

De menţionat este faptul că atât CD28 cât şi CTLA-4 se leagă de aceeaşi liganzi (CD80 şi CD86) pe suprafaţa APC. CTLA-4 inhibă producţia de IL2 şi proliferarea celulelor T, fiind implicat în inducţia şi menţinerea toleranţei⁷.

Specimen recoltat – sânge venos⁴. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant⁴.

Volum proba – 5 mL sânge⁴.

Stabilitate proba – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei⁴.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁴.

Metoda – citometrie in flux⁴.

Valori de referinţă, comunicarea şi interpretarea rezultatelor

Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei pacientului  împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute⁴.

Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile circadiane au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp ce limfocitele CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în cursul după-amiezei. Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populaţiilor limfocitare se recomandă ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al zilei⁵.

Orientativ, prezentăm câteva modele patologice de imunofenotipare asociate unor afecţiuni maligne:

• epiteliom al buzei (operabil): scăderea valorilor procentuale pentru celulele T totale (CD3+), T activate ( CD3+/HLA DR+) şi NK ( CD16+/CD56+);
• adenocârcinom de col uterin (stadiul I – II): scăderea proporţiei de celule T CD8+ (probabil T citolitice) şi, inconstant, scăderea celulelor NK (CD16+/CD56+);
• adenocârcinom mamar (stadiul II): limfopenie, scăderea celulelor T totale (CD3+), B totale (CD19+), scăderea raportului CD4+/CD8+, creşterea celulelor T CD8+ (probabil T supresoare);
• adenocârcinom pulmonar (operabil): limfopenie, scăderea celulelor T totale (CD3+), T activate (CD3+/HLA DR+), inconstant scăderea celulelor B (CD19+)⁹.

Creşterea celulelor T reglatoare în cursul terapiei imunostimulatoare este nefavorabilă, datorită proprietăţilor imunosupresoare ale acestora⁴.