Mastocitoză sistemică – mutația c-kit D816V

Informaţii generale

Mastocitoza este recunoscuta in majoritatea cazurilor ca reprezentand o boala clonala a celulei progenitoare hematopoietice pluripotente, mutatia cea mai comuna fiind reprezentata de mutatia activatoare la nivelul codonului 816 al genei c-Kit⁴. Manifestarile clinice ale bolii caracterizate prin proliferarea patologica a mastocitelor includ prurit, flushing, greata, varsaturi, diaree, dureri abdominale, ulcer si instabilitate vasculara. Trasaturile patologice dominante sunt reprezentate de acumularea anormala de mastocite in piele, tractul gastrointestinal, maduva, ficat, splina, ganglionii limfatici si asocierea frecventa a acestei cresteri a numarului de mastocite cu afectiuni hematologice. Mastocitoza poate aparea la orice varsta, prevalenta exacta nefiind cunoscuta, aparitia familiala fiind neobisnuita. Se crede in prezent ca diferitele variante ale bolii sunt in parte dependente de polimorfisme specifice mostenite genetic si mutatii somatice dobandite si sunt impartite in mastocitoza cutanata si sistemica. Clasificarea acestor pacienti se bazeaza pe prezentarea clinica, anomaliile patologice si prognostic³.

Tabelul 1. Clasificarea WHO a mastocitozei

Mastocitele se gasesc in mod normal in tesuturi, in general localizate in apropierea suprafetelor epiteliale, vaselor de sange, nervilor si glandelor. Ele deriva din celulele progenitoare pluripotente CD34+ (celulele stem) care dau nastere mastocitelor, celulelor T, celulelor B si monocitelor. In afara unei populatii de mastocite care se gaseste in maduva osoasa, maturatia completa are loc in tesuturile periferice. Rolul biologic al mastocitelor ramane in mare parte speculativ, bazat in general pe studii in vitro si modele animale, cu 2 exceptii principale, reactiile de hipersensibilitate imediata mediate-IgE si mastocitoza. Mastocitele pot fi caracterizate fie ca mastocite ale mucoaselor, fie mastocite ale tesutului conjunctiv, primele predominand in plaman si mucoasa tractului gastrointestinal si continand o triptaza specifica (mastocite tip T), iar ultimele fiind aflate mai frecvent in derm si tesuturile submucoase si continand atat triptaza cat si chimotriptaza (mastocite CT). Granulele mastocitare contin de asemenea heparina, condroitin sulfat proteoglicani, TNF-α, histamina, hidrolaze acide, catepsina G, carboxipeptidaza. Impreuna acesti mediatori sunt responsabili de semnele clinice ale reactiei de hipersensibilitate imediata, incluzand prurit, flushing, palpitatii, de asemenea raportate la multi pacienti cu mastocitoza. De asemenea activarea mastocitara duce la sinteza si secretia de factori de crestere si citokine, incluzand  MIP 1-α, BFGF, NGF, TNF, GM-CSF, VEGF, IL1-6, 8-10, 13,16^3,4.

Studiile efectuate au aratat ca multe aspecte ale dezvoltarii mastocitelor sunt reglate in mod critic de SCF (Stem Cell Factor), mecanismul prin care acesta promoveaza supravietuirea mastocitelor fiind inactivarea factorului de transcriptie FOXO3a si reducerea fosforilarii tintei sale, o proteina proapoptotica Bim⁴.

Kit, receptorul pentru SCF, este o tirozin kinaza tip III transmembranara, care apartine aceleeasi subfamilii ca si receptorii PDGF, Flt3 si M-CSF. Kit este exprimat de celulele progenitoare hematopoietice, celulele pacemaker gastrointestinale, melanocite si celulele germinale. Kit scade de pe suprafata celulelor progenitoare pe masura ce acestea se diferentiaza, mastocitele reprezand o exceptie de la acest fenomen, ele mentinand expresia de suprafata a Kit la nivele ridicate in stadiul de celule mature^3,4. Stimularea Kit de catre ligandul sau, SCF, duce la dimerizarea sa si activarea activitatii sale tirozin kinazice intrinseci. Reziduuri specifice de tirozina se autofosforileaza, ceea ce are ca urmare activarea unor cai de semnalizare in aval, incluzand calea Ras/Erk si calea PI3-kinazei. Domeniul care regleaza activitatea proteinei Kit este domeniul de activare A loop⁶. Kit exercita functii critice in biologia celulelor germinale feminine si masculine, regland ovogeneza, foliculogeneza si spermatogeneza³.

Kit este codificat de c-Kit, localizata pe cromozomul 4 (q11-12)³. Mutatii ce duc la pierderea functionala a Kit duc la defecte in hematopoieza, melanogeneza si gametogeneza, spre exemplu piebaldismul, o afectiune a pigmentarii autosomal dominanta caracterizata prin prezenta de portiuni de piele si par albe. Mutatiile missense c-Kit pot sa apara in exonul 11 (care codifica regiunea juxtamembranara), gasite predominant in tumori stromale gastrontestinale, sau in exonul 17 (care codifica regiunea activatoare a domeniului kinazic A loop). Un tip de mutatie frecvent aparuta in exonul 17 este la nivelul codonului 816, mutatie gasita in cateva malignitati umane, incluzand leucemia acuta mieloida, mastocitoza, tumori ale celulelor germinale, limfomul sino-nazal cu celula NK/T, teratoame intracraniale. Aceste mutatii in codonul 816 duc la substitutia acidului aspartic cu valina, tirozina, fenilalanina, asparagina sau histidina^4,6.

Mutatiile Asp816 in c-Kit (activatoare) se asociaza cu activarea constitutiva a tirozin kinazei si promoveaza autofosforilarea ligand-independenta a receptorului, conferind mastocitelor activate un avantaj de supravietuire fata de celulele normale. Cea mai comuna mutatie a c-Kit  este substitutia acidului aspartic cu valina, D816V, mecanismul prin care mutanta oncogenica „semnalizeaza” fiind numai partial cunoscute⁶.  Mutatia D816V este intalnita la >80% din pacientii cu mastocitoza sistemica si poate reprezenta o potentiala tinta terapeutica⁵.

Heterogenitatea clinica nu poate fi explicata prin existenta aceleeasi mutatii la majoritatea pacientilor. Astfel, cel putin la unii pacienti, una sau mai multe mutatii aditionale independente in celulele progenitoare CD34+ sau in alte celule ar putea constitui baza moleculara responsabila pentru fenotipul bolii. Nu exista inca dovezi ca mutatia D816V trece de la o generatie la alta³.

Au fost identificate si alte mutatii ce pot juca un rol in etiologia mastocitozei la unii pacienti, cum ar fi V560G (in domeniul juxtamembranar al Kit) detectata in leucemia mastocitara, D816Y, D816F, D816H, precum si E839K (mutatie inactivatoare) in cateva cazuri raportate de mastocitoza la copii si mutatia rara a liniei germinale F522C, caile semnalizarii intracelulare responsabile de oncogeneza nefiind pe deplin elucidate in toate cazurile, desi alterarea asocierii Kit mutant cu subunitatea p85 a fosfatidilinozitol 3`-kinazei pare a juca un rol in cresterea ligand-independenta si supresia apoptozei. Mutatii extrem de rare, prezente la <1% din pacientii cu mastocitoza, includ R815K, D820G, V533D, V559A, del419, K509I, A533D⁴.

Figura 1: Reprezentare schematica a proteinei Kit si localizarea mutatiilor; domeniul extracelular contine 5 domenii imunoglobulin-like, domeniul intracelular codifica 2  domenii repetitive tandem ale domeniului catalitic enzimatic. Mutatiile in codonul 560 in regiunea juxtamembranara si codonul 816/820 unde are loc autofosforilarea proteinei Kit, in timp ce mutatia la nivelul codonului 839 are ca efect pierderea functiei receptorului.

Adaptare dupa J Mol Diagn. 2005 May; 7(2): 252–257

Mutatia c-Kit D816V sau o alta mutatie similara activatoare este in general considerata un eveniment precoce cromozomial important pentru dezvoltarea bolii la majoritatea pacientilor adulti si la unii copii. Mutatia c-Kit devine initial detectabila in mastocitele din leziunile cutanate. Este in prezent acceptat ca majoritatea adultilor cu mastocitoza prezinta mutatia D816V daca sunt examinate celulele mononucleare din maduva. Pe masura expansiunii clonale si progresia bolii, mutatia poate deveni detectabila in celulele sanguine periferice. Astfel, analiza mutatiilor c-Kit este cel mai bine efectuata pe maduva osoasa⁴. Desi celulele T si B ale acestor pacienti poarta o mutatie a codonului 816 (ca de ex. D816V), spre deosebire de mastocite, aceste celule cand devin mature nu exprima Kit pe suprafata, putand fi astfel mai putin susceptibile efectelor biologice ale Kit activat constitutional.

In plus fata de caile Kit-dependente, inhibarea apoptozei mastocitare prin alte mecanisme biologice poate duce de asemenea la mastocitoza, spre exemplu prin implicarea PDGFRβ, care codifica pentru o tirozin kinaza imatinib-sensibila.

Cresterea numarului de mastocite nu este limitata la mastocitoza, spre exemplu unii pacienti cu leucemie eozinofilica cronica care poarta o proteina de fuziune FIP1L1-PDGFRα prezinta de asemenea numar crescut de mastocite si niveluri serice crescute de triptaza, manifestarile clinice putandu-se suprapune cu cele ale mastocitozei sistemice cu eozinofilie. Identificarea mutatiei c-Kit sau a proteinei de fuziune este necesara pentru diferentierea acestor pacienti cu evolutie clinica, prognostic si tratament diferite^3,4.

Mutatia poate fi detectata in ADN-ul extras din biopsie cutanata, ADN din sange periferic sau din maduva osoasa.

Recomandări pentru mutaţia c-Kit D816V – diagnosticul mastocitozei sistemice².

Specimen recoltat – a) sange venos; b) aspirat medular¹.

Recipient de recoltare – a) si b) vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant¹.

Cantitate recoltată – a) 3-5 mL; b) 3 mL (minimum 1 mL)¹.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant¹.

Stabilitate probă – 7 zile la 2-8ºC¹.

Metodă – secventierea exonului 17¹.

Interpretarea rezultatelor

Detectia unei mutatii la nivelul codonului 816 este inclusa ca unul din criteriile minore de diagnostic pentru mastocitoza sistemica in clasificarea WHO a neoplaziilor hematopoietice, prezentand de asemenea relevanta terapeutica, intrucat imatinibul este ineficient in majoritatea cazurilor de mastocitoza sistemica asociate cu mutatia D816V in c-Kit^2,3,6.

Aceste mutatii sunt mai usor identificate la pacientii cu boala mai severa datorita expansiunii clonale a celulelor derivate din progenitorii neoplazici. Astfel, prezenta mutatiei c-Kit in smouldering SM este un marker de prognostic nefavorabil. De asemenea formele agresive de mastocitoza la copii se asociaza adesea cu o mutatie identificabila in c-Kit⁴.

Limite şi interferenţe

In unele cazuri de mastocitoza sistemica mutatia poate fi prezenta numai in mastocite. Deoarece aceste celule rareori circula in sange si sunt dificil de obtinut in numar semnificativ in specimenele de aspirat medular, rezultate fals negative pot aparea daca celulele neoplazice sunt prezente sub limita de sensibilitate a testului².

Mutatiile c-Kit, inclusiv D816V, pot fi de asemenea prezente la putini pacienti cu tumori ale celulelor germinale sau alte tumori nonmastocitare cu sau fara mastocitoza sistemica coexistenta⁴.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

2. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. “Kit Asp816Val Mutation Analysis, Qualitative PCR”. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Metcalfe D, „Mast Cells and Mastocytosis”. Blood, 2008, 112 (4): 946-956.

4. Worobec A, Metcalfe D. „Systemic Mastocytosis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 2054-66.

5. Schumacher J A, Elenitoba-Johnson K S, Lim, M S. “Detection of the c-Kit D618V Mutation in Systemic Mastocytosis by Allele Specific PCR”, J Clin Patol, 2008, 61:109-114.

6. Sun J, Pedersen M, Rönnstrand L. „The D816V Mutation of c-Kit Circumvents a Requirement for Src Family Kinases in c-Kit Signal Transduction”. J Biol Chem (2009), 284 (17):11039-11047.