Аутоиммунные заболевания печени расширенного профиля - Блот

Аутоиммунные заболевания печени включают:

• Аутоиммунный гепатит (AIH)
• Примитивный билиарный цирроз (ПБК)
• Примитивный склерозирующий холангит (PSC).

Кроме того, могут возникать синдромы overlap(Перекрестный аутоиммунный синдром), например, одновременное наличие двух аутоиммунных заболеваний печени или связь аутоиммунного заболевания печени с другим аутоиммунным заболеванием, таким как системный склероз1.

Аутоиммунный гепатит (AIH)-это хроническое воспалительное заболевание неточной этиологии, характеризующееся наличием циркулирующих аутоантител, гипергамаглобулинемии, гистопатологической картины с некрозом паренхиматозных клеток и лимфоплазмоцитарным воспалительным инфильтратом, а также резким ответом на иммунодепрессивную терапию.

Патогенный механизм постулирует, что на фоне генетической предрасположенности вмешательство определенных триггеров вызывает аномальный иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами, который приведет к повреждению печени. Опубликованные данные показали, что 40% пациентов с необработанным тяжелым заболеванием страдают от смерти в течение 6 месяцев после постановки диагноза, а у выживших часто развиваются цирроз, варикозное расширение вен пищевода и кровоизлияния. Таким образом, чем раньше будет начата иммунодепрессивная терапия и продолжится устойчиво, тем выше продолжительность жизни пациента с диагнозом аутоиммунный гепатит.

AIH представляет собой редкое заболевание со средней частотой 1-2 случая на 100 000 жителей. Хотя заболевание встречается преимущественно у молодых женщин, оно может поражать детей и взрослых любого возраста из всех этнических групп.

AIH дебютирует утомляемостью, тошнотой, болью в суставах и желтухой.

Диагноз основывается на клинических симптомах и признаках, лабораторных тестах и выявлении гистологической воспалительной реакции. Важно исключить другие причины хронического гепатита (вирусного, метаболического, генетического или токсического) и отличить его от других аутоиммунных заболеваний печени. Основными критериями диагностики АИГ являются следующие:

Гистологические данные гепатита

• Обнаружение аутоантител (ANA, ASMA, LKM, SLA/LP)
• Гипергамаглобулинемия
• Отрицательные серологические тесты на HCV и HBV
• Связь с антигенами HLA B8, DR3 или DR4.

Диагноз весьма вероятен при выполнении 4 из 5 критериев и завершен при выполнении всех 5 критериев. Благоприятный ответ на иммунодепрессивную терапию подтверждает диагноз1; 2;3; 4.

В 1994 году была предложена классификация AIH на 3 основных типа:

1. Тип I (связанный с ANA и/или ASMA),
2. тип II (связанный с анти-lkm1 и/или анти-LC) и
3. тип III (связанный с анти-SLA /LP).

Тип III заболевания является спорным в том смысле, что неясно, является ли он самой сущностью или является вариантом типа I2;4;5.

Аутоантитела возникают у большинства пациентов с AHI, но их роль в патогенезе все еще остается спорной. Также нет четкой корреляции между активностью или прогнозом заболевания и титром аутоантител.

Основными аутоантителами, связанными с AIH, являются:

• Антиядерные антитела (АНА))
• Антитела к гладкой мускулатуре, ASMA
• Антитела к LKM-1
• Антитела к LC1 (liver cytosol type 1)
• Антитела к растворимому антигену печени, anti-SLA/LP1;4;6.

Антитела к LKM-1 распознает как целевой антиген цитохром P450 2D6 (CYP2D6) 50 КДА, микросомальный антиген из эндоплазматического ретикулума. Антитела направляются в эпитоп, расположенный между аминокислотами CYP2D6 263-270. Экспрессия этого антигена на поверхности гепатоцитов может указывать на патогенную роль этих антител. Они встречаются с более высокой частотой в педиатрической популяции, где их титр можно использовать для мониторинга активности заболевания и реакции на лечение.

Антитела к LKM-1 также могут встречаться с низкой частотой (1-2% случаев) у пациентов с хроническим гепатитом С, а также с гепатитом С галотаном.

Антитела к ASMA направлены против некоторых структур в составе цитоскелета, таких как актин, тропонин, тропомиозин, виментин (преимущественно против F-актина). ASMA были обнаружены с помощью непрямой иммунофлуоресценции на желудке, почках и печени грызунов, поскольку они содержат повышенное количество актина в мышечной структуре. Антиактиновые аутоантитела связаны с ранним началом заболевания (имеют повышенную значимость в детской патологии), с наличием гаплотипа HLA A1-B8-DR3, с частыми рецидивами лечения и с показанием трансплантата 1;6;7.

Антитела к растворимому антигену печени были описаны в 1987 году как направленные против белка цитозоля, обнаруженного в повышенных концентрациях в ткани печени и почек. Анти-LP были описаны перед анти-SLA (1981) другой группой исследователей как имеющие реактивность к растворимому белку в гомогенном лизате печени и поджелудочной железы. Позже было показано, что анти-SLA и анти-LP идентичны (анти-SLA/LP) и что антиген-мишень представлен цитозольным белком 50 КДА ce, участвующим в биосинтезе селено-белков (uga-suppressor serine-tRNA-associated protein). Эти антитела высокоспецифичны для AIH с распространенностью 10-30% 1; 2; 4. Кроме того, была выявлена значительная корреляция между сыворотками, показывающими анти-SLA/LP и анти-Ro-52, в том смысле, что у пациентов с анти-SLA/LP и анти-Ro-52-положительным заболеванием печени повышенная активность и более тяжелое течение 7.

Антитела к LC1 возникают в AIH типа II, обнаруживаются в 50% позитивных сывороток LKM. Некоторые авторы связывают его с ANA и ASMA, а также с хроническим гепатитом С. Они признают в качестве целевого антигена формиминотрансферазу-циклодеаминазу и коррелируют с активностью заболевания 2;4;7.

Другие антитела, которые все еще могут возникать при AIH:

• Атипичные p-ANCA
• АнтиLKM-3 направлены против фермента УДФ-глюкуронилтрансферазы-1 и встречается у пациентов с хроническим гепатитом D и AIH типа II)
• Анти-LKM2 для него основным антигеном является цитохромоксидаза CYP 2С9 и связан с гепатитом В тикринафене)
• Антитела к ASGP-R представляют собой новый маркер аутоиммунного гепатита1.
• Анти-D-3 фосфоглицератдегидрогеназа • анти-PGDH) была обнаружена в исследовании, проведенном Xiang D et al у 80% пациентов с нелеченным аутоиммунным гепатитом и у 61% пациентов, получавших кортикотерапию 8.

Серологическое разнообразие антител привело к гипотезе о том, что AIH представляет собой гетерогенную группу заболеваний. Эта гипотеза подтверждается ассоциацией в 10-18 % случаев мультиорганического синдрома (APECED), характеризующегося хроническим слизисто-кожным кандидозом, эктодермальной дистрофией и аутоиммунным разрушением тканей различных эндокринных желез (гипопаратиреоз, надпочечниковая недостаточность, гипогонадизм)1;7.

Примитивный билиарный цирроз (ПБК) встречается в 90% случаев у женщин среднего возраста. Заболеваемость в разных регионах мира составляет 4-31 случай / 1 миллион жителей в год. Клинически пациенты испытывают утомляемость, зуд, артралгию, боль в животе, прерывистую обструктивную желтуху. Патогномониками для этого состояния являются антимитоохондрические антитела (АМА), которые встречаются у 95% пациентов. Они преимущественно нацелены на субъединицу E2 комплекса пируватдегидрогеназы (PDC-E2, антиген M2). Этот антиген экспрессируется на уровне печени вокруг желчных протоков, а аутоантитела приводят к разрушению желчных протоков при вторичном холестазе. Диагноз ПБК принимается во внимание, если:

1. Тесты на холестаз положительные (ALP, GGT)
2. AMA положительные
3. Гистопатологическое исследование показывает хронический негревной холангит с прогрессирующим разрушением желчных протоков и фиброзом.

Заболевание может поражать как печень, так и железы с экзокринной функцией (слюнные, слезные железы, поджелудочная железа). Повышенные титры AMA поддерживают диагноз PBC и могут иметь прогностическую ценность для дальнейшего развития PBC у пациентов с симптомами холестаза. AMA также можно обнаружить при синдромах overlap PBC-AIH, системном склерозе (6%) и Синдром Шегрена1;5;6.

Антитела к M2-3E (анти-BPO, анти-MIT3) направлены против белка, полученного в результате слияния 3 субъединиц E2 BCOADH (2-оксокислотная дегидрогеназа branched-chain), пируватдегидрогеназы (PDH), а также оксоглутаратдегидрогеназы (OGDH). Поскольку 4-13% сывороток пациентов с ПБК распознают только антиген BCOADH-E2 использование теста к M2-3e может повысить чувствительность обнаружения ПБК по сравнению с классическими тестами к M2 (PDC-E2)7.

Другие специфичные для PBC аутоантитела:

• Антитела к gp210 распознает антиген ядерной мембраны 210 КДА и встречается у 10-47% пациентов с ПБК, что связано с тяжелым прогрессированием заболевания.
• Антитела  к Sp100 встречаются у 20% пациентов с ПБК и направлены против структур, называемых ядерными телами (“ядерные точки”), которые при непрямой иммунофлуоресценции имеют пунктирный вид и которые были впервые выявлены в ядрах злокачественных клеток. Эти ядерные тела, содержащие некроматиновые волокна, представляют собой комплекс, состоящий из следующих компонентов: антиген sp100, антиген PML (promyelocytic leukemia factor), LYSP 100, NDP55 и NDP 53.
  * Антитела к NUP62 • Нуклеопорин p62) встречаются в 32% случаев PBC5;7.

Менее специфичными для PBC являются антитела против рецептора ламинина B и антициклина A.

Также могут встречаться:

• антитела к центромерным белкам (CENP A, CENP B), которые, по-видимому, демонстрируют связь с портальной гипертензией; они также часто обнаруживаются при синдромах overlap PBC / системный склероз9;
• антитела к Ro-52 ce обнаруживаются примерно в 28% случаев PBC, связанных с более поздними гистологическими изменениями, более высокими уровнями IgM и билирубина в сыворотке по сравнению с пациентами без анти-Ro-527.

Лечение ПБК требует снижения холестаза и улучшения функции печени; он состоит из введения урсодезоксихолевой кислоты и холестирамина. В тяжелых случаях показана трансплантация печени 1; 3; 6.

Особая ситуация представлена синдромами overlap PBC-AIH, в которых антитела AMA ассоциируются с антителами AIH (10-20% случаев). Эти синдромы могут сосуществовать с самого начала (PBC-AIH), или PBC может прогрессировать до AIH. Выявление синдромов overlap очень важно из-за доказанной эффективности лечения кортикостероидами. Критерии Paris5 были разработаны для диагностики синдромов AIH-PBC overlap:

Примитивный склерозирующий холангит (PSC) встречается с частотой 4 случая на 100 000 жителей в год. В клинической картине преобладают симптомы и признаки холестаза. Диагноз основан на изменениях лабораторных тестов, гистологическом исследовании и ретроградной эндоскопической холангиопанкреатографии (ERCP). В основном страдают мужчины, и в 50% случаев язвенный колит также ассоциируется. Аутоантителами, выявленными при этом состоянии, являются атипично выглядящие p-ANCA при непрямой иммунофлуоресценции, направленные к антигенам: катепсин G, лактоферрин, каталаза, Альфа-енолаза. Они также могут иногда появляться в AIH и PBC1;6.

Рекомендации по проведению обширного профиля аутоиммунного заболевания печени-Блот-диагностика первичного билиарного цирроза, повышение уровня трансаминаз неясной этиологии, пациенты с клиническим подозрением на аутоиммунный гепатит; синдром overlap1; 7.

Подготовка пациента-натощак или после приема пищи (после еды)7.
Собранный образец-венозная кровь 7.
Контейнер для сбора материала-vacutainer без антикоагулянта с / без сепараторного геля 7.
Необходимая обработка после сбора материала - отделяем сыворотку центрифугом7.
Объем образца-минимум 1 мл сыворотки7.

Причины отказа от образца: гемолизированный образец; желтушный, липемический образец; бактериально загрязненный образец 7.
Стабильность образца-отдельная сыворотка стабильна 14 дней при 2-8ºC и длительное время при-20ºC. Не размораживайте / не замораживайтеь6.
Метод-иммуноблот. В тесте используются 14 очищенных нативных и рекомбинантных антигенов,которые фиксируются в параллельных чипах на мембране полосы. Антигены представлены в порядке фиксации на полосе:

-AMA M2: очищенный родной антиген
-M2-3E (BPO): рекомбинантный антиген
-Sp100: рекомбинантный антиген
-PML: рекомбинантный антиген
-gp210: рекомбинантный антиген
- LKM1: рекомбинантный антиген
- LC - 1: рекомбинантный антиген
- SLA / LP: рекомбинантный антиген
- SS-A: очищенный нативный антиген
- Ro 52: рекомбинантный антиген
- Scl-70: очищенный нативный антиген
- CENP - A: рекомбинантный антиген
- CENP-B: рекомбинантный антиген
- PGDH: рекомбинантный антиген.

На первом этапе полоска, загруженная очищенными антигенами, инкубируется вместе с разбавленной сывороткой пациента. Если в сыворотке присутствуют специфические антитела, они будут связываться с соответствующими антигенами на полосе. После стадии промывки полоску инкубируют с конъюгатом к IgG человека, меченным щелочной фосфатазой. Конъюгат присоединится к части IgG комплекса антиген-антитело. После промывочного удаления несвязанного конъюгата добавляют окрашивающий раствор (субстрат фермента) – колориметрическую систему обнаружения ферментов . Если связанный конъюгат присутствует ферментативная реакция будет демонстрировать темно-синий цветной продукт на уровне полос, занятых специфическими антителами. Таким образом, полосы, визуализированные на уровне полосы, являются результатом связывания специфических антител с отдельными антигенами на уровне полосы. На каждой полосе есть внутренняя контрольная полоса. Возникновение интенсивной цветовой реакции на этом уровне подтверждает, что все этапы иммуноблот-теста были выполнены правильно 7.

Контрольные значения и интерпретация результатов

Окончательная интерпретация результатов теста выполняется с помощью программного обеспечения (после сканирования полос), которое в зависимости от интенсивности сигнала дает оценку для каждой полосы полосы полосы, например: