Page 91 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

fixat de faza solidă. Metodele competitive necesită cantităţi mai mici de Ac şi Ag decât metodele tip
“sandwich”.
Testele “sandwich”/radioimunometrice utilizează o cantitate mare de Ac (exces stoichiometric) legat
de faza solidă, fiind mai sensibile decât metodele competitive. Ac legat de faza solidă captează Ag
(analitul) din soluţie; după spălare conjugatul reacţionează cu Ag legat de faza solidă şi semnalul
este măsurat după îndepărtarea prin spălare a conjugatului liber, semnalul generat fiind proporţional
cu concentraţia de analit. Aceste teste necesită Ag cu mai mult de două situsuri antigenice. Dacă se
utilizează doi Ac diferiţi (care recunosc situsuri antigenice diferite), protocolul poate fi simplificat (“one
step sandwich”); astfel faza solidă este mixată simultan cu Ag din probă şi conjugatul.
Metoda poate fi aplicată pentru detecţia de Ac utilizând Ag ca fază solidă şi Ag marcat radioactiv.
Comparativ cu alte teste imune, RIA prezintă avantajul unei sensibilităţi ridicate (~5 pg/mL), usurinţă
în conjugarea izotopului, detecţia semnalului fără optimizare şi stabilitate faţă de interferenţe;
dezavantajele sunt stabilitatea scurtă a reactivului şi necesitatea protecţiei antiradioactive .
4
În laboratorul Synevo această tehnică este utilizată la determinarea aldosteronului seric şi urinar,
1,25-(OH) vitaminei D, markerului TPA etc .
2
2
Teste imunoenzimatice
Acest tip de teste utilizează marcarea cu enzime, care reprezintă alternativa pentru radioizotopi. Cele
mai folosite sunt testele ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), EIA şi EMIT (Enzyme-
Multiplied Immunoassay Technique).
Testele EIA necesită un proces secundar pentru obţinerea semnalului prin acţiunea catalitică a enzimei.
Ca fază solidă pentru separarea conjugatului liber de cel legat se pot folosi plăcuţe cu godeuri, bile
de plastic, tuburi de plastic, particule magnetice sau latex cu filtre. Utilizarea particulelor magnetice
şi a latexului asigură scurtarea timpului de reacţie. Enzimele cel mai des folosite sunt peroxidaza
din hrean, fosfataza alcalină, beta-galactozidaza, glucozoxidaza, ureaza şi catalaza. În funcţie de
substratul clivat enzimatic utilizat se disting:
- EIA colorimetrice: utilizează substraturi cromogene, cum ar fi ABTS (sarea diamoniu a 2,2`-azino-di
(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonat) care formează cu H O sub acţiunea peroxidazei culoarea verde sau
2
2
p-nitrofenil fosfat care formează culoarea galbenă sub acţiunea fosfatazei alcaline. Un spectrofotometru
măsoară densitatea optică a cromogenului rezultat.
- EIA cu fluorescenţă (FEIA): utilizează substraturi fluorescente, în urma reacţiei enzimatice fiind generat
un fluorofor, care emite lumina de o lungime de undă caracteristică în urma excitaţiei sale luminoase
optime. Instrumentul utilizat (fluorometru) necesită o sursă de lumină şi un tub fotomultiplicator pentru
detecţia emisiei fluorescente. În proba de analizat pot exista substanţe care emit lumină fluorescentă
care pot interfera cu sensibilitatea testului. Comparativ cu EIA colorimetrice testele fluorescente
generează o intensitate a semnalului mai mare cu cel puţin un ordin de mărime. În laboratorul Synevo
metoda FEIA este folosită pentru determinarea IgE specifice pentru diverşi alergeni şi a markerilor
pentru afecţiuni reumatismale.
- EIA cu chemiluminiscenţă (CL-EIA) utilizează substraturi chemiluminiscente care reacţionează cu
diferitele enzime folosite pentru marcare; reacţia enzimatică chemiluminiscentă generează lumina.

91