Page 92 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

Sistemele curente utilizează derivaţi de luminol cu peroxidază şi H O (sau un alt sistem enzimatic care
2
2
generează H O , cum ar fi glucozoxidaza sau uricaza) plus un potenţiator (derivaţi de fenol, cum ar fi
2
2
p-iodofenol), care creşte emisia de lumină de până la 2800 de ori. Reacţiile oxidative ale luminolului
pot prezenta numeroase interferenţe care cresc semnalul nespecific. Un alt sistem utilizează fosfataza
alcalină şi un derivat de adamantil dioxetan, AMPPD, care nu necesită alte molecule pentru emisia de
lumină, spre deosebire de luminol care necesită compuşi oxidativi. AMPPD este un substrat complet
format dintr-un grup adamantil ca stabilizator al întregii molecule, o legătură dioxetan ca sursă de
energie, un fosforil ester ca situs pentru clivajul enzimatic şi un grup fenil pentru chemiluminiscenţă.
Acest nou substrat a făcut posibilă dezvoltarea de teste extrem de sensibile superioare testelor RIA
ca sensibilitate (~0.1 pg/mL), timp şi simplitate procedurală.
În laboratorul Synevo se efectuează prin această metodă următoarele teste: hormon de creştere,
IGF-1, ACTH, calcitonina, Helicobacter pylori IgG etc.
EIA, ca şi RIA, pot fi împărţite în teste competitive (cu exces de analit, care utilizează conjugat Ag-
enzimă) şi necompetitive (cu reactant în exces), care includ teste “sandwich” imunometrice pentru
determinarea de Ag (hormoni, markeri tumorali, agenţi infecţiosi, proteine plasmatice) şi teste indirecte
pentru determinarea de Ac (antiHCV, autoAc).
Avantajele testelor imonoenzimatice sunt reprezentate de dezvoltarea de teste sensibile prin efectul
de amplificare al enzimei, reactivi relativ ieftini şi stabili, lipsa riscului radioactiv; ca şi dezavantaje,
măsurarea activităţii enzimatice poate fi mai complexă decât măsurarea activităţii unor radioizotopi,
iar activitatea enzimatică poate fi influenţată de constituenţi plasmatici.
Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): reprezintă o metodă sensibilă deoarece
fiecare moleculă de enzimă poate converti multe molecule de substrat servind ca amplificator al
reacţiei. Enzimele produc produşi coloraţi care precipită, astfel încât nu difuzează de la locul de
formare. În laboratorul Synevo testele ELISA sunt automatizate (ex: determinarea de testosteron liber,
17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac anticardiolipinici IgG, Ac antispermatozoizi, serologie paraziţi,
etc.).
Ag este legat la o suprafaţă solidă, Ac primar se leagă de Ag, iar Ac secundar marcat cu o enzimă se
leagă de Ac primar; enzima converteşte substratul într-un produs colorat, care formează un precipitat,
proporţional cu cantitatea de Ac din serul pacientului .
2;4
Metoda ELISA de tip “sandwich”/cu Ag capturat creşte specificitatea metodei, necesitând legarea Ac
la doi epitopi diferiţi (reacţiile încrucişate pot avea loc la unul dintre epitopi, dar este puţin probabil
să aibă loc la ambii epitopi simultan). Ac monoclonal este legat la suprafaţa solidă şi leagă Ag, dacă
acesta este prezent în serul pacientului; materialul nelegat este spălat; un al doilea Ac marcat, care
recunoaşte un epitop diferit, se leagă la Ag; o nouă spălare îndepărtează Ac nelegaţi, apoi se adaugă
substratul, care este convertit într-un produs colorat, proporţional cu cantitatea de Ag prezentă în serul
testat (vezi figura 5.3.1).

92