Page 88 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

faza staţionară decât o altă moleculă, atunci cea din urmă va migra prin coloană mai rapid decât
prima moleculă. Soluţia de analizat este adaugată prin partea superioară a coloanei şi este apoi
eluată cu solvent; fracţiunile sunt colectate prin partea inferioară a coloanei. Există mai multe varietăţi
de cromatografie în coloană: cromatografia cu gel filtrare (excludere moleculară), cromatografia
cu schimb de ioni, cromatografia cu fază inversă, cromatografia cu gaz-lichid, cromatografia cu
interacţiuni hidrofobe, cromatografia cu afinitate, cromatografia cu separare.
In cromatografia cu gel-filtrare (excludere moleculară) moleculele dintr-o soluţie sunt separate în funcţie
de mărimea lor pe măsură ce trec printr-o coloană de bile legate între ele într-o reţea tridimensională.
Aceste bile polimerice (dextran, agaroză sau acrilamid) prezintă pori de anumite dimensiuni. Pe
măsură ce o probă trece prin coloană moleculele mai mari decât dimensiunile porilor nu vor pătrunde
în ochiurile reţelei rămânând în soluţie, astfel încât ele vor elua primele din coloană. Moleculele mai
mici vor pătrunde prin pori în ochiurile reţelei şi astfel se vor deplasa mai lent prin coloană şi vor elua
ultimele din soluţie. Pe măsură ce proba eluează la capătul coloanei fracţiunile sunt colectate în
tuburi. Fracţiunile eluate sunt apoi testate pentru determinarea compoziţiei şi cantităţii componentelor
respective prin spectrofotometrie, electroforeză sau teste funcţionale. Cromatografia cu gel filtrare
este utilizată în primul rând pentru a purifica proteine sau alte molecule şi poate fi utilizată pentru
estimarea mărimii unor proteine necunoscute (coloane calibrate cu proteine cu GM cunoscută).
În cromatografia cu schimb de ioni moleculele sunt separate pe baza încărcăturii lor ionice. Faza
staţionară este reprezentată de o răşină cu încărcătura fixă; dacă această încărcătură este negativă
(carboximetil celuloză), procesul se numeşte cromatografie cu schimb de cationi, iar dacă încărcătura
este pozitivă (dietilaminoetil celuloză), este cromatografie cu schimb de anioni. Faza mobilă este
reprezentată de o soluţie tampon. Atunci când o proteină trece prin coloană se poate lega de matrice şi
poate fi în continuare eluată prin creşterea concentraţiei ionice a soluţiei tampon (eluţia poate fi privită
ca o competiţie pentru situsurile de legare ale matricei; pe măsură ce puterea ionică a tamponului
creşte, o sare ionică din tampon va ocupa un situs al matricei şi proteina va fi eluată din coloană).
PH-ul soluţiei tampon este critic în cromatografia cu schimb de ioni. Există două căi de efectuare
a eluţiei: prin gradient, în care concentraţia salină creşte constant şi gradual în timpul procesului
de eluţie şi eluţia bruscă, în care modificarea în concentraţia salină este abruptă. Electroforeza, ca
şi cromatografia cu schimb de ioni, poate fi utilizată ca un instrument eficient pentru analiza unui
amestec de ioni. O fâşie de hârtie sau gel polimeric saturată cu un electrolit este aşezată astfel încât
să traverseze două soluţii care conţin electrozi. Amestecul de analizat este aplicat pe hârtie/gel şi
cei doi electrozi sunt conectaţi la o sursă de înaltă energie (~5000 volţi). Ionii pozitivi vor migra într-o
direcţie, iar cei negativi în cealaltă direcţie. Cu cât este mai mare încărcătura ionului, cu atât va migra
mai departe. Metoda este în mod special utilă pentru separarea amestecurilor proteice.
În cromatografia cu fază inversă moleculele sunt legate de o matrice hidrofobă (hidrocarburi cu lanţ
lung legate de o matrice de silicon) într-un tampon hidrofil. Moleculele pot fi apoi eluate prin scăderea
polarităţii tamponului, de exemplu prin creşterea concentraţiei de alcool sau alt solvent nepolar din
tampon.
Cromatografia cu afinitate este utilizată mai mult în scop de cercetare; moleculele sunt separate pe
baza unor aspecte specifice ale structurii şi activităţii lor biologice. Sunt utilizaţi liganzi care sunt
imobilizaţi într-o matrice de suport, din care este efectuată o coloană; peste coloană se toarnă proba
care conţine proteina de interes şi care se leagă de liganzii continuţi în coloană; proteina este apoi

88