Page 53 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

5.4 Alte metode folosite pentru determinarea testelor imunologice şi serologice

ReacŃii de aglutinare: celule sau particule sunt legate unele de altele prin interacŃiunea Ag-Ac; Ag sau Ac ataşaŃi la
particule, cum ar fi eritrocite, latex sau particule metalice, reacŃionează cu analitul din probă; ca urmare a reacŃiei
imune particulele prezintă o aglutinare semnificativă, care poate fi observată cu ochiul liber. O haptenă cu un singur
situs de legare nu poate fi aglutinată decât prin legare de o fază solidă. ReacŃiile de aglutinare sunt foarte sensibile: o
cantitate mică de Ac poate aglutina o masă mare de particule. De asemenea sunt foarte rapide, având loc în câteva
minute. Datorită sensibilităŃii (~5 ng/mL) şi rapidităŃii lor sunt larg utilizate. Aglutinarea directă/pasivă este utilizată
pentru detecŃia de Ac cu Ag specifice; aglutinarea inversă este utilizată pentru detecŃia de Ag solubile dintr-o probă cu
Ac corespunzători. ReacŃiile de aglutinoinhibare se bazează pe principiul competitiv în care aglutinarea particulelor de
care este legată o haptenă cu o cantitate limitată de Ac este inhibată de haptena liberă prezentă în specimenul de
analizat.
Hemaglutinarea reprezintă aglutinarea eritrocitelor indusă de Ac. Fiind o moleculă pentamerică, IgM este o
hemaglutinină mai bună decât IgG.
Hemaglutinarea pasivă: utilizează eritrocite la care un Ag a fost legat chimic; aglutinarea evidenŃiază Ac faŃă de Ag
respectiv. AplicaŃii în laboratoarele Synevo: grupajul ABO (metoda serică Simonin); TPHA (test de hemaglutinare
pentru Treponema pallidum).
Hemaglutinarea pasivă inversă: utilizează eritrocite la care au fost legaŃi Ac; acestea sunt aglutinate de Ag. AplicaŃii în
laboratoarele Synevo: reacŃia Waaler-Rose pentru factor reumatoid.
Sensibilitatea testelor de hemaglutinare este de ~50 ng/mL pentru detecŃia de Ag (analit).
Aglutinarea particulelor de gelatina/alte particule sintetice utilizează particule speciale neantigenice care elimină
problemele legate de prezenŃa Ac heterofili când sunt utilizate eritrocitele ca particule; poate înlocui orice test bazat pe
hemaglutinare, cu excepŃia testelor care utilizează eritrocitele din proba de testat ca particule; asigură o detecŃie mai
sensibilă decât atunci când sunt utilizate celulele sanguine.
ConcentraŃia Ac poate fi determinată prin titrare: se efectuază diluŃii seriale ale serului; la fiecare diluŃie succesivă
concentraŃia Ac scade cu un factor de 2. La o anumită diluŃie nu va mai exista o cantitate suficientă de Ac care să
reacŃioneze cu toate Ag; titrul Ac reprezintă factorul de diluŃie al ultimului tub în care are loc reacŃia completă:

Exemplu:

Tub 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DiluŃie 1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512
Agregare + + + + + + + - - -

Titru = 1:64.

ReacŃia poate fi inhibată la concentraŃii serice crescute de Ac. Inhibitorii sunt de obicei prezenŃi în concentraŃii mici. Pe
măsură ce inhibitorii sunt diluaŃi, reacŃia devine pozitivă. Rezultatul iniŃial negativ este denumit “prozonă”. AplicaŃii în
laboratoarele Synevo: RPR cantitativ.

ReacŃii de precipitare: complexul Ag-Ac formează un precipitat vizibil, care poate fi observat calitativ cu ochiul liber
sau cantitativ de către un detector. Formarea precipitatului necesită formarea de agregate moleculare mari prin legarea
Ag de către Ac. Complexele mici rămân solubile. Formarea de complexe mari necesită ca atât Ag, cât şi Ac să fie
multivalente. Cantitatea de precipitat depinde atât de concentraŃia absolută de Ag şi Ac, cât şi de concentraŃia lor
relativă. Dacă Ac sau Ag sunt în exces unul faŃă de celălalt, se formează un număr mic de complexe solubile,
precipitatul fiind redus cantitativ/absent şi cu Ac, respectiv Ag libere în soluŃie. Pe măsură ce cantităŃile de Ac şi Ag se
apropie una de cealaltă, începe să se formeze precipitatul. Raportul de concentraŃie la care se formează cantitatea
maximă de precipitat şi nici Ac, nici Ag nu rămân în soluŃie reprezintă punctul de echivalenŃă. Alte condiŃii, ca
temperatura, pH-ul, încărcătura ionică a mediului şi afinitatea şi aviditatea Ac sunt la fel de importante în formarea
precipitatului imun. Sensibilitatea limitată a reacŃiilor de precipitare (aproximativ 10 µg/mL) reprezintă o problemă
majoră.

ReacŃii de precipitare în agar
Dubla difuzie Ouchterlony: Ag şi Ac se plasează în două godeuri pe o plăcuŃă cu gel agar şi difuzează unul spre
celălalt. ConcentraŃiile de Ag şi Ac sunt maxime la nivelul celor două godeuri şi scad cu distanŃa spre zero, astfel încât
cele două curbe de concentraŃie trebuie să se intersecteze într-un anumit punct reprezentând punctul de echivalenŃă,