Page 56 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

5.6 Metodele PCR utilizate pentru determinările de biologie moleculară

ReacŃia de polimerizare în lanŃ PCR (polimerase chain reaction) are la bază o tehnologie in vitro care imită capacitatea
naturală de replicare a ADN şi care constă în generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvenŃe nucleotidice Ńintă
(ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin
diverse metode. Numărul de copii ale secvenŃei Ńintă creşte exponenŃial cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece
fiecare secvenŃă nucleotidică nou sintetizată constituie o matriŃă pentru o nouă copie. Produsul PCR care reprezintă o
copie a ADN/ARN Ńintă original este denumit amplicon. Această metodă permite detectarea cu specificitate foarte mare
a unor concentraŃii foarte scăzute ale secvenŃei Ńintă.
Amplificarea se realizează într-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reacŃie trebuie să conŃină
următoarele elemente:
- ADN sau ARN Ńintă: extras din probă în cursul etapei de prelucrare;
- enzima care facilitează sinteza lanŃului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq (izolata din
Thermophilus aquaticus) pentru o Ńintă ADN sau RTth ADN polimeraza – pentru o Ńintă ARN- care are
activitate atât de revers-transcriptază, cât şi de ADN polimerază (permite realizarea în acelaşi amestec de
reacŃie, atât a transcrierii inverse a ARN Ńintă în ADN complementar -ADNc- cât şi amplificarea ADNc);
2+
- cofactori enzimatici: Mg şi/sau Mn ;
2+
- primeri (P1 si P2): secvenŃe scurte, monocatenare, cu lungimea maximă 20-30 nucleotide, care se leagă de
o matriŃă monocatenară prin împerecherea complementară a bazelor; servesc ca punct de plecare pentru
sinteza lanŃului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcând începutul şi sfârşitul regiunii care
trebuie să fie amplificată;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP şi dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin ataşarea lor la
capătul primerilor, complementar cu matriŃa (observaŃie: ampliconul va conŃine deoxiuridină în loc de o
deoxitimidină, deosebindu-l de ADN nativ);
- amperaza: enzima care promovează amplificarea selectivă a Ńintei şi distrugerea produşilor de contaminare
din cursul reacŃiilor de amplificare anterioare; catalizează clivarea ADN-ului care conŃine deoxiuridina la
începutul primului ciclu de amplificare şi nu degradează ADN-ul sau ARN-ul Ńintă .
1

ReacŃia PCR se desfăşoară în 3 etape:
1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacŃie la 94ºC, ADN-ul Ńintă este separat (denaturat) în 2
catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scăderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor ataşa complementar la
capetele 3’ ale celor 2 catene;
3. ElongaŃia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabilă în prezenŃa Mn 2+ şi a excesului de
deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina şi deoxiuridina) va extinde primerii
ataşaŃi în lungul matriŃei Ńintă şi va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces
pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de amplicon ADN
2
(vezi fig.5.6.1) .
AMPLIFICAREA ADN PRIN PCR
ADN tinta

P1 Taq P2

CICLUL I

CICLUL II

Fig.5.6.1