Page 58 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

probei, amplificare PCR şi detecŃie, ca şi secvenŃa Ńintă. QS conŃine secvenŃe VHB cu zone identice de legare a
primerilor ca şi ADN-ul Ńintă, dar cu o zona unică de legare a sondei de detecŃie care permite diferenŃierea ampliconului
QS de ampliconul Ńintei. Analizorul calculează concentraŃia ADN-VHB prin comparararea semnalului Ńintei cu semnalul
QS din fiecare probă şi controale.
ExtracŃia acizilor nucleici se face automat printr-o tehnică de captură la suprafaŃa unor biluŃe magnetice de sticlă.
Particulele virale sunt lizate prin incubarea la temperatură ridicată cu o protează şi un tampon care eliberează acizii
nucleici şi îi protejează de acŃiunea DNA-zelor din plasmă. În fiecare probă este introdus ADN QS într-o concentraŃie
cunoscută, împreună cu proteaza, agentul lizant şi biluŃele de sticlă. După ce are loc incubarea amestecului, ADN VHB
şi ADN VHB QS vor fi captaŃi la suprafaŃa biluŃelor de sticlă, în timp ce subsŃantele nelegate vor fi îndepărtate printr-un
proces de spălare. După încheierea etapei de spălare, acizii nucleici adsorbiŃi vor fi eluaŃi cu o soluŃie apoasă la
temperatură înaltă. Proba procesată, ce include biluŃele de sticlă împreună cu ADN VHB şi ADN VHB QS, va fi
adăugată amestecului de amplificare şi transferată în analizorul în care vor avea loc amplificarea şi detecŃia .
1
În cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face în prezenŃa unui sistem raportor care emite fluorescenŃă.
DetecŃia se realizează cu ajutorul sondelor de tip 5’ nuclează-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capăt cu o
substanŃă fluoroforă (“reporter dye” R) şi la celălat capăt cu o moleculă blocantă (“quencher dye” Q). Cât timp sonda
este intactă, fluorescenŃa sistemului R va fi inhibată de molecula Q. În cazul în care amplificarea este eficientă,
moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; în cursul etapei de elongaŃie, ADN polimeraza
Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatică de 5’ endonuclează şi va elibera astfel fluoroforul (vezi
fig.5.6.3) .
2;3

Fig. 5.66
l
f
u
d

e
c
e
t

i
Ń
e
o
r
M e t o d a d de detecŃie e a a fluorescenŃei e i
Ń
Metoda
e
n
c
e
s

Taqman n
T
m
a
q
a

R R Q Q

T Taq q
a

Fig.5.6.3

Energia emisă de fluorofor în urma excitării în UV va fi înregistrată la sfârşitul fiecărui ciclu de amplificare, fiind
proporŃională cu cantitatea de ADN Ńintă prezentă în tub până în momentul respectiv . Sondele HBV şi HBV QS sunt
3
marcate cu fluorofori R diferiŃi, permiŃând înregistrarea independentă a emisiilor lor . Înregistrările sunt folosite pentru
1
generarea unei curbe de amplificare cu 3 regiuni: o regiune de latenŃă în care acumularea de ADN nu atinge încă
punctul limită de detecŃie a semnalului; o regiune de amplificare exponenŃială şi o regiune de platou, în care
3
amplificarea secvenŃei Ńintă încetează în special datorită epuizării enzimei şi inhibiŃiei prin cantitatea mare de ADN . Cu
cât este mai mare titrul de ADN VHB din probă, cu atât mai devreme fluorescenŃa emisă se va ridica deasupra nivelului
bazal de fluorescenŃă (vezi fig.5.6.4) .
1