Page 60 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

Analiza mutaŃiei factorului V Leiden
Metoda permite detectarea şi genotiparea unei mutaŃii punctiforme a genei umane care codifică factorul V. Prin
intermediul unor primeri specifici se asigură amplificarea unui fragment ADN Ńintă din gena factorului V, izolat printr-o
tehnică automată dintr-o probă de sânge integral.
Pentru efectuarea testului se utilizează sistemul PCR LightCycler care foloseşte o detecŃie în timp real prin
fluorescenŃă a produsului amplificat diferită de cea obŃinută cu ajutorul sondei TaqMan. Astfel, pentru detecŃia
ampliconului se folosesc 2 sonde care hibridizează la o secvenŃă internă a fragmentului amplificat, în cursul fazei de
hibridizare a primerilor. Sondele sunt reprezentate de 2 secvenŃe oligonucleotidice specifice, marcate cu fluorofori
diferiŃi:
- sonda 1, marcată la capătul 3’ cu fluoresceină (fluoroforul donator D);
- sonda 2, marcată la capătul 5’ cu substanŃa LightCycler Red 640 (fluoroforul acceptor A).
SecvenŃele celor 2 sonde sunt astfel selectate încât să hibridizeze la secvenŃele Ńintei într-un aranjament de tip cap-
coadă, facilitând apropierea celor 2 fluorofori. Fluoresceina este excitată de lumina albastră emisă de o sursă a
LightCycler-ului şi emite o lumină fluorescentă verde. Ca urmare a apropierii celor 2 fluorofori în cursul fazei de
hibridizare, energia emisă excită la rândul său fluoroforul Red 640, printr-un transfer de energie a rezonanŃei
fluorescente (FRET: fluorescence resonance energy transfer - vezi fig.5.6.6 ); acesta va emite o lumină fluorescentă
roşie, a cărei intensitate va fi măsurată în unitatea optică a LightCycler-ului. Cantitatea de fluorescenŃă emisă va fi
1;2
proporŃională cu nivelul Ńintei .

Metoda de
detecŃie a
fluorescenŃei
Light cycler
D

A

Fig.5.6.6

Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutaŃiei, prin analiza curbei de topire
efectuată după încheierea ciclurilor de amplificare, când ampliconul este prezent în concentraŃii crescute.
Sonda marcată cu Red 640 hibridizează la o secvenŃă a Ńintei care nu conŃine situsul mutaŃiei (sondă ancoră); sonda
marcată cu fluoresceină hibridizează la o secvenŃă care include situsul respectiv (sondă a mutaŃiei). În cursul analizei
curbei de topire, creşterea semnificativă a temperaturii induce scăderea fluorescenŃei emise, deoarece sonda cu o
secvenŃa mai scurtă (sonda mutaŃiei) este prima care disociază şi cei 2 fluorofori nu mai sunt în apropiere. Dacă este
prezentă mutaŃia factorului V, nepotrivirea sondei mutaŃiei cu Ńinta va destabiliza hibridul, astfel că scăderea
fluorescenŃei se va înregistra la temperaturi mai joase. În prezenŃa genotipului sălbatic (fără mutaŃie), heteroduplexul
ADN este stabil şi va avea o temperatură de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezintă o combinaŃie distinctă de
proprietăŃi.
Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie să prezinte întotdeauna un profil al curbei de topire pentru unul din cele 3
genotipuri: tipul homozigot sălbatic (mutaŃie absentă), mutant homozigot sau genotip heterozigot. Dacă nu se produce
acest lucru, testul va fi considerat invalid şi vor trebui repetate toate etapele.
În plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ şi pozitiv, cu menŃiunea că, pentru acesta din
urmă trebuie să se obŃină obligatoriu un profil de genotip heterozigot .
1
1
Pentru analiza mutaŃiei protrombinei se foloseşte o metodă similară .