Page 57 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

La rândul său, procesul global de amplificare desfăşurat de-a lungul unui număr definit de cicluri poate fi divizat în 3
faze:
· ExponenŃială: la fiecare ciclu se dublează cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienŃă de 100% a
reacŃiei);
· Lineară: pe măsură ce componentele reacŃiei sunt consumate, se produce o încetinire a reacŃiei iar produşii
PCR încep să se degradeze;
· Platou (end-point): reacŃia este stopată, nu se mai formează alŃi produşi de amplificare, iar dacă faza se
prelungeşte mult produşii PCR vor suferi o degradare importantă.
Metodele PCR tradiŃionale (convenŃionale) au la bază o detecŃie a produşilor PCR în faza de platou a procesului
(detecŃie end-point). În ultimii ani, tehnologia PCR a fost revoluŃionată prin dezvoltarea metodelor de detecŃie în faza
exponenŃială (detecŃie în timp real: real-time PCR ).
Tehnologia real-time PCR prezintă numeroase avantaje faŃă de cea convenŃională:
- acurateŃe mai mare a rezultatelor obŃinute (efectuarea detecŃiei se realizează în faza precoce a reacŃiei, respectiv în
faza de creştere exponenŃială a amplificării, când se produce o dublare exactă a cantităŃii de amplicon la fiecare ciclu;
detecŃia în acest moment este optimă în sensul că rezultatele se corelează mai bine cu nivelul iniŃial al Ńintei,
comparativ cu tehnica PCR convenŃional, unde detecŃia are loc în faza de platou, după ce reacŃia a fost stopată iar
produşii au început să se degradeze - vezi fig.5.6.2);
- domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai puŃine diluŃii ale probelor);
- limita inferioară de detecŃie mult îmbunătăŃită (se pot detecta cantităŃi mai mici ale ADN-ului Ńintă, avantaj esenŃial,
spre exemplu, în evaluarea răspunsului virusologic susŃinut la pacienŃii cu hepatită cronică cu virus C) .
1;2

Aria de detecŃie pt PCR convenŃional

Aria de Platou
detecŃie pt
Real-Time

PCR

ExponenŃială Liniară

ADN

Nr. de cicluri
Fig. 5.6.2

În laboratorul Synevo cele 2 tipuri de metode PCR se aplică la efectuarea următoarelor teste:
· Real-time PCR: determinarea cantitativă a viremiei la pacienŃii infectaŃi cu virusurile hepatice B sau C;
analiza mutaŃiei factorului V Leiden şi a mutaŃei protrombinei;
1
· PCR convenŃional: detecŃia calitativă a tipurilor oncogene ale virusului papilomatozei umane (HPV) .
Determinare cantitativă a viremiei
Vom descrie în acest document etapa de determinare a încărcăturii virale B, cu menŃiunea că recent în laboratorul
nostru s-a trecut de la tehnologia convenŃională PCR la tehnologia real-time PCR Taqman cu prelucrarea automată a
probelor. Particularitatea o constituie metoda de detecŃie a produsului PCR, care este cuantificat în cursul desfăşurării
reacŃiei (‘în timp real”) prin monitorizarea fluorescenŃei emise la fiecare ciclu de amplificare, spre deosebire de detecŃia
1;2
colorimetrică care avea loc la sfârşitul reacŃiei, în tehnologia convenŃională .
Testele de determinare a viremiei VHB se bazează pe 2 procese majore:
- pregătirea probei pentru a izola ADN-VHB;
- amplificarea PCR a ADN-ului Ńintă cu detecŃia simultană a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice
Ńintei.
Cuantificarea viremiei se realizează cu ajutorul unei secvenŃe ADN neinfecŃioase denumită Quantitation Standard
(QS). ADN QS cu un număr cunoscut de copii este adăugat în fiecare probă şi parcurge aceleaşi etape de preparare a