Page 62 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1
P. 62
5.7 Metode utilizate în microbiologie
Frotiul
Depistarea rapidă a microorganismelor şi studiul morfologiei necesare unui diagnostic microbiologic corect se
1;5
realizează prin examen microscopic .
Examenul microscopic poate fi proaspăt, între lamă şi lamelă sau fixat şi colorat .
Prin frotiu se înŃelege material microbian (produs patologic sau cultură microbiană) etalat în strat subŃire pe suprafaŃa
unei lame de microscop. Pentru efectuarea unui frotiu se folosesc lame de microscop curate şi degresate care se
marchează la una din extremităŃi cu numele pacientului şi materialul microbian ce urmează a fi etalat .
2
Pentru fiecare produs patologic obişnuit se efectuează 2 frotiuri (excepŃie fac lichidele de puncŃie din care se fac 4
frotiuri), unul se colorează Gram (pentru evidenŃierea bacteriilor), iar al doilea Giemsa (pentru celularitate).
Frotiul din produs patologic poartă denumirea de examen microscopic colorat şi are un rol deosebit în bacteriologia
medicală. El ajută în:
- orientarea către un diagnostic rapid în caz de urgenŃă medicală (ex.meningita bacteriană);
- orientarea microbiologului în respingerea unor produse patologice necorespunzătoare (ex.salivă, în loc de spută);
- corelarea dintre acesta şi cultură, ce permite trecerea de la diagnosticul prezumtiv la diagnosticul de certitudine .
3;5
Aproape toate bacteriile cu importanŃă clinică pot fi detectate la examenul microscopic colorat, excepŃie făcând: acele
bacterii care trăiesc aproape exclusiv intracelular e.g. Chlamydia, cele care se găsesc în peretele celular
(ex.Mycoplasma şi Ureaplasma) şi cele care au dimensiuni insuficiente pentru a fi vizualizate la microscop
(ex.spirochetele) .
1
4
ColoraŃiile folosite în bacteriologie sunt :
• ColoraŃiile simple - utilizează un singur colorant şi evidenŃiază doar morfologia microbilor: dimensiune, formă,
gruparea celulelor, prezenŃa capsulei. Dintre coloraŃiile simple, uzuală şi rapidă este coloraŃia cu albastru de metilen
2
care colorează în albastru toate elementele celulare: bacterii, leucocite, celule epiteliale .
• ColoraŃiile diferenŃiale - evidenŃiază în afara caracterelor morfologice şi reacŃiile de culoare ale microbilor.
ColoraŃia Gram şi coloraŃia Ziehl-Neelsen (Z.N.) sunt cele mai utilizate în bacteriologie.
Comportarea diferită a bacteriilor în coloraŃia Gram Ńine de diferenŃele structurale ale peretelui bacterian. Bacteriile
Gram-pozitive apar colorate în violet, iar cele Gram-negative în roşu. Leucocitele şi celulele epiteliale apar cu
citoplasma colorată în roz şi nucleul în roşu 2;3;5 .
ColoraŃia Ziehl-Neelsen este folosită pentru identificarea următoarelor grupe de bacterii: Mycobacterium, Nocardia,
Rhodococcus, Tsukamurella şi oochiştii de Cryptosporidium, Isopora, Sarcocystis şi Cyclospora .
5
Uzual în bacteriologie coloraŃia Z.N. este folosită pentru decelarea Mycobacteriilor. Acestea, spre deosebire de alte
bacterii, datorită prezenŃei în peretele bacterian a unor substanŃe ceroase, se colorează la cald cu fucsina bazică şi
rezistă la decolorarea cu acizi minerali diluaŃi şi cu alcool. Bacilii acido-alcoolo-rezistenŃi apar coloraŃi în rosu, iar
bacteriile neacido-rezistente apar colorate în albastru la fel ca leucocitele şi celulele tisulare, a căror citoplasmă se
2
colorează în albastru deschis cu nucleul albastru închis .
În timp s-au dezvoltat numeroase modificări de la metoda originală descrisă de Ziehl în 1882 şi Neelsen în 1883, cea
mai utilizată fiind cea descrisă de Kinyoun .
6
• ColoraŃii speciale pentru structuri particulare ale unor bacterii (capsula - tuş India; granulaŃii metacromatice - Del
Vecchio, spori-verde malachit).
Controlul intern de calitate al frotiurilor este obligatoriu şi se face cu martor pozitiv şi negativ .
3
În cazul coloraŃiei Gram folosim următorii martori:
- martor pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC 25923;
- martor negativ: Escherichia coli ATCC 25922
Cultura
Bacteriile aparŃinând unor specii diferite pot avea caractere microscopice asemănătoare, de aceea identificarea lor
2
presupune şi studiul caracterelor fiziologice care sunt cercetate "in vitro" pe medii de cultură .
Cultura bacteriană reprezintă rezultatul creşterii şi multiplicării bacteriilor într-un mediu nutritiv şi are ca scop:
• izolarea microorganismelor patogene din prelevatele patologice;
• identificarea agentilor patogeni;
• testarea sensibilităŃii la antibiotice în vederea iniŃierii şi monitorizării terapiei antimicrobiene .
5