Page 48 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

reacŃie. Enzimele cel mai des folosite sunt peroxidaza din hrean, fosfataza alcalină, beta-galactozidaza, glucozoxidaza,
ureaza şi catalaza. În funcŃie de substratul clivat enzimatic utilizat se disting:
- EIA colorimetrice: utilizează substraturi cromogene, cum ar fi ABTS (sarea diamoniu a 2,2`-azino-di (3-etil-
benzotiazolin-6-sulfonat) care formează cu H2O2 sub acŃiunea peroxidazei culoarea verde sau p-nitrofenil fosfat care
formează culoarea galbenă sub acŃiunea fosfatazei alcaline. Un spectrofotometru măsoară densitatea optică a
cromogenului rezultat.
- EIA cu fluorescenŃă (FEIA): utilizează substraturi fluorescente, în urma reacŃiei enzimatice fiind generat un fluorofor,
care emite lumina de o lungime de undă caracteristică în urma excitaŃiei sale luminoase optime. Instrumentul utilizat
(fluorometru) necesită o sursă de lumină şi un tub fotomultiplicator pentru detecŃia emisiei fluorescente. În proba de
analizat pot exista substanŃe care emit lumina fluorescenta care pot interfera cu sensibilitatea testului. Comparativ cu
EIA colorimetrice testele fluorescente generează o intensitate a semnalului mai mare cu cel puŃin un ordin de mărime.
În laboratorul Synevo metoda FEIA este folosită pentru determinarea IgE specifice pentru diverşi alergeni şi a
markerilor pentru afecŃiuni reumatismale.
- EIA cu chemiluminiscenŃă (CL-EIA) utilizează substraturi chemiluminiscente care reacŃionează cu diferitele enzime
folosite pentru marcare; reacŃia enzimatică chemiluminiscentă generează lumina. Sistemele curente utilizează derivaŃi
de luminol cu peroxidază şi H2O2 (sau un alt sistem enzimatic care generează H2O2, cum ar fi glucozoxidaza sau
uricaza) plus un potenŃiator (derivaŃi de fenol, cum ar fi p-iodofenol), care creşte emisia de lumină de până la 2800 de
ori. ReacŃiile oxidative ale luminolului pot prezenta numeroase interferenŃe care cresc semnalul nespecific. Un alt
sistem utilizează fosfataza alcalină şi un derivat de adamantil dioxetan, AMPPD, care nu necesită alte molecule pentru
emisia de lumină, spre deosebire de luminol care necesită compuşi oxidativi. AMPPD este un substrat complet format
dintr-un grup adamantil ca stabilizator al întregii molecule, o legătură dioxetan ca sursă de energie, un fosforil ester ca
situs pentru clivajul enzimatic şi un grup fenil pentru chemiluminiscenŃă. Acest nou substrat a făcut posibilă dezvoltarea
de teste extrem de sensibile superioare testelor RIA ca sensibilitate (~0.1 pg/mL), timp şi simplitate procedurală.
În laboratorul Synevo se efectuează prin această metodă următoarele teste: hormon de creştere, IGF-1, ACTH,
calcitonina, dublu şi triplu test, Helicobacter pylori IgG etc.
EIA, ca şi RIA, pot fi împărŃite în teste competitive (cu exces de analit, care utilizează conjugat Ag-enzima) şi
necompetitive (cu reactant în exces), care includ teste “sandwich” imunometrice pentru determinarea de Ag (hormoni,
markeri tumorali, agenŃi infecŃiosi, proteine plasmatice) şi teste indirecte pentru determinarea de Ac (antiHCV, autoAc).
Avantajele testelor imonoenzimatice sunt reprezentate de dezvoltarea de teste sensibile prin efectul de amplificare al
enzimei, reactivi relativ ieftini şi stabili, lipsa riscului radioactiv; ca şi dezavantaje, măsurarea activităŃii enzimatice poate
fi mai complexă decât măsurarea activităŃii unor radioizotopi, iar activitatea enzimatică poate fi influenŃată de
constituenŃi plasmatici.
Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): reprezintă o metodă sensibilă deoarece fiecare moleculă de
enzimă poate converti multe molecule de substrat servind ca amplificator al reacŃiei. Enzimele produc produşi coloraŃi
care precipită, astfel încât nu difuzează de la locul de formare. În laboratorul Synevo testele ELISA sunt automatizate
(ex: determinarea de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac anticardiolipinici IgG, Ac
antispermatozoizi, serologie paraziŃi, etc.).
Ag este legat la o suprafaŃă solidă, Ac primar se leagă de Ag, iar Ac secundar marcat cu o enzimă se leagă de Ac
primar; enzima converteşte substratul într-un produs colorat, care formează un precipitat, proporŃional cu cantitatea de
2;4
Ac din serul pacientului .
Metoda ELISA de tip “sandwich”/cu Ag capturat creşte specificitatea metodei, necesitând legarea Ac la doi epitopi
diferiŃi (reacŃiile încrucişate pot avea loc la unul dintre epitopi, dar este puŃin probabil să aibă loc la ambii epitopi
simultan). Ac monoclonal este legat la suprafaŃa solidă şi leagă Ag, dacă acesta este prezent în serul pacientului;
materialul nelegat este spălat; un al doilea Ac marcat, care recunoaşte un epitop diferit, se leagă la Ag; o nouă spălare
îndepărtează Ac nelegaŃi, apoi se adaugă substratul, care este convertit într-un produs colorat, proporŃional cu
cantitatea de Ag prezentă în serul testat (vezi figura 5.3.1).