Page 47 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

5.3 Metode automate de determinare a markerilor imunologici

Paleta largă de markeri endocrini, tumorali, infecŃioşi, cardiaci, osoşi, alergologici şi de autoimunitate efectuaŃi în
laboratoarele Synevo se determină prin metode automate care au la bază reacŃia antigen-anticorp, metode denumite
2
imunochimice (echivalentul termenului “immunoassay” din literatura engleză de specialitate) .
Recunoaşterea specifică dintre Ag şi Ac caracteristică testelor imune a devenit larg utilizată ca metodă analitică.
Testele imunochimice pot fi utilizate fie pentru determinarea antigenelor, fie a anticorpilor. Sensibilitatea testelor
imunologice a crescut prin dezvoltarea unor noi tipuri de sisteme de detecŃie a semnalului şi tehnologiei cu fază solidă,
astfel încât ele pot detecta <0.1 pg/mL de Ag prezent în sânge. Ele pot fi aplicate pentru detecŃia de molecule mici
(haptene), dar şi a unor complexe proteice macromoleculare, ca şi pentru Ac faŃă de alergeni, agenŃi infecŃioşi sau Ag
autologe.
Principala caracteristică a testelor imunochimice constă în marcarea Ag sau a Ac cu o substanŃă care generează un
semnal ce poate fi măsurat, facilitând astfel detecŃia complexului Ag-Ac. În funcŃie de tipul acestei substanŃe testele
imunochimice sunt clasificate astfel:
131
125
32
14
3
- teste radioimunologice (RIA): utilizează marcarea cu radioizotopi ( I, I, H, C, P);
- teste imunoenzimatice (EIA): utilizează marcarea cu enzime;
- teste imunochimice cu detecŃie prin fluorescenŃă (FIA): utilizează marcarea cu molecule fluorescente (fluorocromi);
- teste imunochimice cu detecŃie prin chemiluminiscenŃă (CLIA): utilizează pentru marcare molecule care generează
chemiluminiscenŃa, cum ar fi derivaŃi de luminol, esteri acridinici, derivaŃi de oxalat de nitrofenil. O variantă a acestora o
constituie testele imunochimice cu detecŃie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA) care utilizează pentru marcare
4
anumiŃi compuşi organici (complexe de ruteniu, osmiu, etc.) care generează lumina electrochimic .

Teste radioimunologice (RIA)
Majoritatea testelor radioimunologice actuale utilizează marcarea cu 125 I care asigură rapiditatea procesului de
conjugare şi menŃinerea activităŃii biologice a reactanŃilor. Emisia radioactivă (raze gammma pentru 125 I) poate fi
măsurată cu ajutorul unui scintilator gamma. Există două tehnici RIA principale, competitive şi necompetitive, care
includ etape de spălare pentru separarea fracŃiunii legate de faza solidă de cea liberă de conjugat radioactiv. Ca fază
solidă pot fi utilizate bile de sefaroză sau peretele interior al unor tuburi de plastic. În metoda competitivă, utilizată
pentru cuantificarea unor molecule mici, cum ar fi hormoni (hormonii sunt prea mici pentru a lega mai mult decât o
moleculă de Ac, astfel încât ei nu pot fi detectaŃi printr-un test care necesită legarea a mai mult decât un Ac), o
cantitate cunoscută de Ag marcat radioactiv şi Ag din proba de analizat sunt mixate şi reacŃionează competitiv cu o
cantitate constantă de Ac legat de o fază solidă. ConcentraŃia de analit este determinată cu ajutorul unei curbe
standard emisii radioactive pe minut versus logaritmul concentraŃiei de analit (cu cât cantitatea de Ag neradioactiv din
proba este mai mare, cu atât radioactivitatea legată este mai mică).
Pentru determinarea de Ac, Ac marcaŃi radioactiv şi Ac din probă reacŃionează competitiv cu Ag fixat de faza solidă.
Metodele competitive necesită cantităŃi mai mici de Ac şi Ag decât metodele tip “sandwich”.
Testele “sandwich”/radioimunometrice utilizează o mare cantitate de Ac (exces stoichiometric) legat de faza solidă,
fiind mai sensibile decât metodele competitive. Ac legat de faza solidă capturează Ag (analitul) din soluŃie; după
spălare conjugatul reacŃionează cu Ag legat de faza solidă şi semnalul este măsurat după îndepărtarea prin spălare a
conjugatului liber, semnalul generat fiind proporŃional cu concentraŃia de analit. Aceste teste necesită Ag cu mai mult
de două situsuri antigenice. Dacă se utilizează doi Ac diferiŃi (care recunosc situsuri antigenice diferite), protocolul
poate fi simplificat (“one step sandwich”), astfel faza solidă este mixată simultan cu Ag din probă şi conjugatul.
Metoda poate fi aplicată pentru detecŃia de Ac utilizând Ag ca fază solidă şi Ag marcat radioactiv.
Comparativ cu alte teste imune, RIA prezintă avantajul unei sensibilităŃi ridicate (~5 pg/mL), uşurinŃă în conjugarea
izotopului, detecŃia semnalului fără optimizare şi stabilitate faŃă de interferenŃe; dezavantajele sunt stabilitatea scurtă a
4
reactivului şi necesitatea protecŃiei antiradioactive .
Deşi metoda a fost folosită în perioada de început a laboratorului Synevo pentru determinările imunochimice, aceasta a
fost înlocuită prin tehnici noi, mai performante .
2

Teste imunoenzimatice
Acest tip de teste utilizează marcarea cu enzime, care reprezintă alternativa pentru radioizotopi. Cele mai folosite sunt
testele ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), EIA şi EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique).
Testele EIA necesită un proces secundar pentru obŃinerea semnalului prin acŃiunea catalitică a enzimei. Ca fază solidă
pentru separarea conjugatului liber de cel legat se pot folosi plăcuŃe cu godeuri, bile de plastic, tuburi de plastic,
particule magnetice sau latex cu filtre. Utilizarea particulelor magnetice şi a latexului asigură scurtarea timpului de