Page 44 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

5.2 Metode de determinare a testelor de biochimie generală,
proteinelor specifice şi a metaboliŃilor urinari

Spectrofotometria
Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizează transmiterea luminii printr-o soluŃie pentru determinarea
concentraŃiei unui solut în soluŃia respectivă. Spectrofotometrul diferă de colorimetru prin modul în care lumina este
separată în lungimile de undă componente. Spectrofotometrul utilizează o prismă pentru separarea luminii, iar
colorimetrul utilizează filtre. Ambele se bazează pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de undă cunoscută
printr-o probă şi măsurarea cantităŃii de energie luminoasă care este transmisă. Aceasta se realizează prin plasarea
unei fotocelule în partea opusă a probei respective. O rază de lumină este formată din fotoni; când un foton întâlneşte
o moleculă de analit, există şanse ca analitul să absoarbă fotonul. Această absorbŃie reduce numărul de fotoni din raza
de lumină, astfel reducând intensitatea luminoasă.Toate moleculele absorb energie radiantă la anumite lungimi de
undă. Cele care absorb energie în spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenŃi. Proteinele şi acizii nucleici absorb
lumina în domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implică o sursă de lumină, o prismă, un suport pentru probe şi o
fotocelulă. Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care controlează intensitatea luminii, lungimea de
undă şi conversia energiei primite la nivelul fotocelulei în fluctuaŃii voltmetrice. FluctuaŃiile voltmetrice sunt apoi
proiectate pe o scală metrică/digitală şi valorile sunt înregistrate într-un computer.
Intensitatea culorii dintr-o probă depinde de cantitatea de solut din proba respectivă. Transmisia luminii nu este o
funcŃie liniară, ci mai degrabă exponenŃială. TransmitanŃa este procentul relativ de lumină care a trecut prin probă.
TransmitanŃa procentuală este transformată într-o funcŃie logaritmică inversă cunoscută ca absorbanŃă (sau densitate
optică).
Legea Beer-Lambert: absorbanŃa este minus log10 din transmitanŃă (A = - log10T). Această valoare este mai utilă decât
transmitanŃa deoarece proiecŃia absorbanŃei versus concentraŃie determină o linie dreapă, absorbanŃa crescând odată
cu creşterea concentraŃiei (transmitanŃa scade odată cu creşterea concentraŃiei de analit).
Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesară stabilirea unei serii cunoscute de diluŃii a unor cantităŃi cunoscute
de solut. Una din acestea nu conŃine solut şi este cunoscută ca “blank”. Este utilizată pentru ajustarea instrumentului
să citească 100% transmitanŃa pentru absorbanŃa 0. O valoare a transmitanŃei de 0% (absorbanŃa infinită) este stabilită
prin plasarea unei bariere între sursa de lumină şi fotocelulă. Toate celelalte măsurători sunt apoi efectuate prin simpla
plasare a probelor în calea luminii. După înregistrarea absorbanŃei pentru o serie de probe standard este efectuată o
dreaptă absorbantă versus concentraŃie. Panta dreptei reprezintă coeficientul de extincŃie. Această valoare este o
constantă şi este utilizată pentru conversia oricărei absorbante măsurate în concentraŃia corespunzătoare (C = A/ε).
Un spectrofotometru poate utiliza atât lumina vizibilă (de obicei având ca sursă de lumină o lampă cu tugsten/halogen),
cât şi lumina UV. Singura modificare necesară este înlocuirea tuburilor de sticlă cu cuvete de quartz (sticla absoarbe
lumina UV şi nu este potrivită pentru un spectrofotometru UV).

Majoritatea testelor de chimie clinică efectuate pe analizorul automat sunt teste colorimetrice, distingându-se
următoarele tipuri de teste:
teste enzimatice colorimetrice în care substanŃa de analizat este tratată cu una sau mai multe enzime
specifice, în urma reacŃiei rezultând hidrogen peroxid, care în prezenŃa unui substrat, sub acŃiunea
peroxidazei duce la formarea unui pigment iminoquinonic care este determinat fotometric, intensitatea culorii
formate fiind proporŃională cu concentraŃia analitului respectiv (ex: determinarea acidului uric cu utilizarea
uricazei);
teste colorimetrice în care substanŃa de analizat se cuplează specific cu reactivul cu formarea unui produs
conjugat colorat care este determinat fotometric (ex.: bilirubina se cuplează cu ionul diazoniu in mediu
puternic acid cu formarea azobilirubinei de culoare roşie); în cazul determinării enzimelor, acestea clivează
enzimatic un substrat specific, produsul rezultat fiind colorat/ se cuplează cu un cromogen şi formează un
complex colorat;
teste UV: NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat în timpul reacŃiilor care au loc este determinat
fotometric în lumina ultravioletă, concentraŃia sa fiind direct, respectiv invers proporŃională cu concentraŃia
analitului de determinat (ex: determinarea ALT si AST).
teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (în timp fix), ceea ce oferă o linearitate mai mare (ex.:
1;2
test kinetic UV pentru determinarea ureei) .
Turbidimetria şi nefelometria: se bazează pe formarea de complexe antigen-anticorp în soluŃie. SoluŃiile de antigen
şi anticorp sunt mixate, fiind necesare cantităŃi foarte mici de reactiv; formarea de agregate survine rapid. Turbidimetria
măsoară cantitatea de lumină transmisă nedeviată prin soluŃie; fotosenzorul este plasat în linie dreaptă cu sursa de