Page 46 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 1

FracŃiunile eluate sunt apoi testate pentru determinarea compoziŃiei şi cantităŃii componentelor respective prin
spectrofotometrie, electroforeză sau teste funcŃionale. Cromatografia cu gel filtrare este utilizată în primul rând pentru a
purifica proteine sau alte molecule şi poate fi utilizată pentru estimarea mărimii unor proteine necunoscute (coloane
calibrate cu proteine cu GM cunoscută).
În cromatografia cu schimb de ioni moleculele sunt separate pe baza încărcăturii lor ionice. Faza staŃionară este
reprezentată de o răşină cu încărcătura fixă; dacă această încărcătura este negativă (carboximetil celuloză), procesul
se numeşte cromatografie cu schimb de cationi, iar dacă încărcătura este pozitivă (dietilaminoetil celuloză), este
cromatografie cu schimb de anioni. Faza mobilă este reprezentată de o soluŃie tampon. Atunci când o proteină trece
prin coloană se poate lega de matrice şi poate fi în continuare eluată prin creşterea concentraŃiei ionice a soluŃiei
tampon (eluŃia poate fi privită ca o competiŃie pentru situsurile de legare ale matricei; pe măsură ce puterea ionică a
tamponului creşte, o sare ionică din tampon va ocupa un situs al matricei şi proteina va fi eluată din coloană). pH-ul
soluŃiei tampon este critic în cromatografia cu schimb de ioni. Există două căi de efectuare a eluŃiei: prin gradient, în
care concentraŃia salină creşte constant şi gradual în timpul procesului de eluŃie şi eluŃia bruscă, în care modificarea în
concentraŃia salină este abruptă. Electroforeza, ca şi cromatografia cu schimb de ioni, poate fi utilizată ca un
instrument eficient pentru analiza unui amestec de ioni. O fâşie de hârtie sau gel polimeric saturată cu un electrolit
este aşezată astfel încât să traverseze două soluŃii care conŃin electrozi. Amestecul de analizat este aplicat pe
hârtie/gel şi cei doi electrozi sunt conectaŃi la o sursă de înaltă energie (~5000 volŃi). Ionii pozitivi vor migra într-o
direcŃie, iar cei negativi în cealaltă direcŃie. Cu cât este mai mare încărcătura ionului, cu atât va migra mai departe.
Metoda este în mod special utilă pentru separarea amestecurilor proteice.
În cromatografia cu fază inversă moleculele sunt legate de o matrice hidrofobă (hidrocarburi cu lanŃ lung legate de o
matrice de silicon) într-un tampon hidrofil. Moleculele pot fi apoi eluate prin scăderea polarităŃii tamponului, de exemplu
prin creşterea concentraŃiei de alcool sau alt solvent nepolar din tampon.
Cromatografia cu afinitate este utilizată mai mult în scop de cercetare; moleculele sunt separate pe baza unor aspecte
specifice ale structurii şi activităŃii lor biologice. Sunt utilizaŃi liganzi care sunt imobilizaŃi într-o matrice de suport, din
care este efectuată o coloană; peste coloană se toarnă proba care conŃine proteina de interes şi care se leagă de
liganzii continuŃi în coloană; proteina este apoi eluată, fie prin modificarea condiŃiilor din coloană (modificarea pH-ului
sau concentraŃiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra în competiŃie cu molecula de interes pentru
situsurile de legare ale liganzilor. Exemple de liganzi în funcŃie de substanŃa de purificat: substrat, inhibitor, cofactor
(pentru enzime), antigene (pentru anticorpi), secvenŃe de baze complementare (pentru acizi nucleici).
Cromatografia lichidă de înaltă performanŃă utilizează pompe care furnizează presiuni înalte care împing solvenŃii prin
coloane metalice. Aceasta creşte viteza procesului de separare şi previne răspândirea soluŃiilor care poate apărea în
cromatografia în coloană gravitaŃională. Separarea are loc în minute în loc de ore şi este net superioară. Utilizând
cromatografia cu fază inversă pot fi separate două proteine a câte 100 aminoacizi fiecare care diferă printr-un singur
aminoacid.
Cromatografia cu gaz utilizează un lichid cu punct de fierbere înalt impregnat într-un suport solid inert ca faza solidă şi
heliu ca fază mobilă, întregul sistem fiind încălzit. Solutul este injectat în coloană şi se volatilizează imediat, heliul
îndepărtând componentele din coloană, fiecare component fiind înregistrat de un detector care determină cantitatea
relativă a acestuia. Polaritatea şi volatilitatea componentelor determină timpul cât acestea sunt reŃinute de coloană.
Capacitatea coloanei în cromatografia cu gaz fiind foarte mică, aceasta este utilizată în principal ca un instrument
analitic.
În cromatografia în strat subŃire şi cromatografia cu hârtie coloana este înlocuită cu un strat adsorbant (silicon,
aluminiu, celuloză) aplicat pe un suport de sticlă/plastic/folie de aluminiu. Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar
solventul este lăsat să se evapore. Apoi componentele sunt eluate cu un solvent care este lăsat să urce pe plăcuŃă prin
acŃiune capilară, antrenând componentele amestecului în grade diferite. În final se aplică un agent oxidant, astfel încât
fiecare component apare ca o pată întunecată pe plăcuŃă, localizarea şi mărimea fiecăreia dintre acestea servind
1
pentru identificarea şi măsurarea cantităŃii relative a componentelor .

AplicaŃii ale cromatografiei în laboratorul Synevo: determinarea acidului vanilmandelic, metanefrinelor şi 17-
2
cetosteroizilor urinari .

Bibliografie

th
1. John Bernard Henry. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 20 edition, 2001.
2. Laborator Synevo. ReferinŃe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2006. Ref Type: Catalog