Page 204 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 2

11 MARKERI VIRALI GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

11.11 Anti - HCV (confirmare)

Utilitatea testului
Acest test este util pentru a confirma prezenţa anticorpilor IgG specifici faţă de virusul hepatitei C în
probele de ser care au dat rezultate reactive (pozitive) la testele screening anti-HCV (efectuate prin
tehnici ELISA sau similare acestora). Este folosit mai ales în băncile de sânge.
Spre deosebire de testele screening, testul de confirmare permite, prin separarea electroforetică a
antigenelor, o detectare a anticorpilor asociaţi cu diferite etape ale infecţiei 1;2;3;4;5 .
Datorită îmbunătăţirii performanţei testelor screening şi dezvoltării tehnicilor moleculare testul de
confirmare este din ce în ce mai mult rezervat cazurilor în care s-au obţinut rezultate slab pozitive la
etapa de screening .
1;3
Pregătire pacient - preferabil à jeun (pe nemâncate) .
4
Specimen recoltat - sânge venos .
4
Recipient de recoltare - vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator .
4
Prelucrare necesară după recoltare - se separă serul prin centrifugare în ziua recoltării .
4
Volum probă - minim 2 mL ser . 4
Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian .
4
Stabilitate probă - serul este stabil 6 zile în condiţii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp îndelungat la
-20°C; evitaţi decongelarea/recongelarea repetată .
4
Metodă - Imunoblot
Testul utilizează 5 antigene HCV recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe
baza greutăţii moleculare prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezenţă de sodium dodecil
sulfat (SDS-PAGE) şi transferate ulterior electroforetic pe o membrană de nitroceluloză (Western
blotting). Situsurile de legare libere de pe membrană sunt saturate cu o soluţie de proteine, după
care matricea este spălată şi tăiată în fâşii (strip-uri). Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării
pe strip, de:
- NS-3: proteină non-structurală cu activitate de helicază virală şi protează;
- Helicază: proteină non-structurală/parte din NS3 cu activitate de helicază virală;
- NS-5-12: proteină non-structurală/parte din NS5 (ARN polimeraza);
- NS-4: proteină non-structurală/partea N-terminală a NS4 cu funcţie neprecizată;
- Core: proteina structurală care formează cea mai mare parte a nucleocapsidei virale.
Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele HCV este incubat împreună cu serul diluat al pacientului.
Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de
pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu
peroxidază. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea
prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare – un sistem de detecţie enzimatică
colorimetrică care conţine peroxid de hidrogen şi 4-cloro-1-naftol. Dacă este prezent conjugatul legat
reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi
specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării de anticorpilor specifici de
antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului .
4

204