Page 103 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

probă de ~ 0.5 mL de sânge periferic recoltat pe heparină; proporţia heparină : sânge
este de 1:20; rolul heparinei este de a împiedica procesul de coagulare care interferă cu
proliferarea celulelor cultivate; diviziunea limfocitelor este stimulată cu fitohemaglutinină
sau concavalina A; după 72 ore de incubare în condiţii sterile la 37°C, diviziunea celulară
este oprită cu colcemid (10 μg/mL timp de 2 ore), un derivat de colchicină care împiedică
formarea fusului mitotic şi blochează celulele în metafază; după 72 ore aproximativ 5%
dintre celule vor fi în mitoză; cultura va fi încheiată după care se va trece la recoltarea
celulelor.
2. Soluţia de cultură este apoi centrifugată la 1000 rpm timp de 10 min cu obţinerea unui
sediment; se adaugă apoi o soluţie hipotonă de clorură de potasiu (timp de 20 minute) după
care se mai efectuează o centrifugare.
3. Se adaugă apoi o soluţie de fixare (un amestec 3:1 de metanol şi acid acetic glacial); de
obicei fixatorul se schimbă de 4-5 ori cu centrifugare consecutivă; celulele astfel fixate sunt
absorbite şi pipetate pe lame de la înălţime pentru a sparge nucleii celulelor; o alternativă
este tratarea cu o soluţie hipotonă timp de 10 minute care produce ruperea nucleilor şi
dispersarea cromozomilor; după uscarea în aer lamele sunt pretratate înainte de etapa de
colorare, fie prin încălzirea într-o soluţie salină, fie, cel mai adesea, prin tratarea de scurtă
durată cu o enzimă proteolitică.
4. După etapa de pretratare lamele sunt imersate în soluţia de colorare; în mod obişnuit
se utilizează colorarea cu soluţie Giemsa, proces în care are loc denaturarea cromatinei
şi colorarea selectivă a ADN-ului cromozomial. Tripsinizarea uşoară are rolul de slăbi
interacţiunea dintre ADN şi proteine şi de a conduce la un aspect bine definit al fiecărui
cromozom, în care benzi luminoase alternează cu cele întunecate, după aplicarea
colorantului. Această metodă de colorare cromozomială este denumită bandare G (de la
Giemsa). Structura benzilor diferă în funcţie de compoziţia ADN-ului, densitatea genelor
şi de secvenţele repetitive. Benzile G intens colorate reprezintă zone puternic condensate
bogate în AT (heterocromatină), în timp ce benzile G mai slab colorate reprezintă zone
mai puţin condensate (eucromatină). Fiecare pereche de cromozomi se caracterizează
printr-un aspect unic al benzilor ce este reprezentat ca o ideogramă (conform Sistemului
Internaţional de Nomenclatură a Cromozomilor, ISCN 2005), aceasta servind la identificarea
fiecărui cromozom şi a regiunilor cromozomiale.
Astfel, fiecare cromozom este divizat în regiuni situate de-a lungul braţelor lung şi
scurt; regiunile sunt numerotate de la centromer la telomer. De exemplu, braţul scurt al
cromozomului 1 începe cu regiunea 1 (în apropierea centromerului), ce conţine o bandă
întunecată şi o bandă luminoasă, urmată de regiunile 2 şi 3. În cadrul fiecărei regiuni benzile
sunt numerotate în direcţia proximal-distal (către telomer); numărul fiecărei benzi derivă
direct din numărul regiunii; de exemplu, benzile 2 şi 3 ale regiunii 2 sunt denumite 22 şi
respectiv 23; benzile 1-6 ale regiunii 3 sunt desemnate prin numerele 31, 32, 33, 34, 35 şi 36.
Denumirea unei benzi oarecare include numărul cromozomului, braţul, regiunea şi numărul
benzii; de exemplu 1p23 indică regiunea 2, banda 3, de pe braţul scurt al cromozomului 1.
Benzile care sunt vizibile cu rezoluţie crescută sunt indicate printr-o zecimală; dacă pot fi
observate benzi suplimentare în 1p23, acestea sunt denumite 1p23.1, 1p23.2, 1p23.3 etc.

103