Page 108 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

5 METODE DE LUCRU GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE
AL LABORATOARELOR SYNEVO

5.6 METODE UTILIZATE PENTRU DETERMINĂRILE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
5.6.1 Reacţia de polimerizare în lanţ (PCR)
şi alte tehnici de amplificare a acizilor nucleici

Dezvoltarea reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR) de către Kary Mullis în 1983 a reprezentat un
moment crucial pentru biotehnologie, care a marcat debutul diagnosticului molecular.
Deşi PCR este cea mai larg utilizată metodă de amplificare a acizilor nucleici există şi alte metode
care prezintă aplicaţii diagnostice; aceste metode se bazează pe amplificarea ţintei, a sondei
oligonucleotidice sau a semnalului.
A. METODE DE AMPLIFICARE A ŢINTEI
Reacţia de polimerizare în lanţ, amplificarea bazată pe transcripţie şi tehnica de amplificare izotermică
SDA (“strand displacement amplification”) constituie exemple de metode de amplificare a ţintei .
6
I. Reacţia de polimerizare în lanţ PCR (“polimerase chain reaction”) are la bază o tehnologie
in vitro care imită capacitatea naturală de replicare a ADN şi care constă în generarea rapidă a
unor copii multiple a unei secvenţe nucleotidice ţintă (ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau
un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numărul de
copii ale secvenţei ţintă creşte exponenţial cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secvenţă
nucleotidică nou sintetizată constituie o matriţă pentru o nouă copie. Produsul PCR care reprezintă
o copie a ADN/ARN ţintă original este denumit amplicon. Această metodă permite detectarea cu
specificitate foarte mare a unor concentraţii foarte scăzute ale secvenţei ţintă.
Amplificarea se realizează într-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de reacţie trebuie să
conţină următoarele elemente:
- ADN sau ARN ţintă: extras din probă în cursul etapei de prelucrare;
- enzima care facilitează sinteza lanţului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq
(izolată din Thermophilus aquaticus) pentru o ţintă ADN sau RTth ADN polimeraza pentru
o ţintă ARN, care are activitate atât de revers-transcriptază, cât şi de ADN polimerază
(permite realizarea în acelaşi amestec de reacţie, atât a transcrierii inverse a ARN ţintă în
ADN complementar -ADNc- cât şi amplificarea ADNc);
2+
- cofactori enzimatici: Mg şi/sau Mn ;
2+
- primeri (P1 şi P2): secvenţe scurte, monocatenare, cu lungimea maximă de 20-30
nucleotide, care se leagă de o matriţă monocatenară prin împerecherea complementară a
bazelor; servesc ca punct de plecare pentru sinteza lanţului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcând începutul şi sfârşitul regiunii care trebuie să fie amplificată;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP şi dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN
prin ataşarea lor la capătul primerilor, complementar cu matriţa (observaţie: ampliconul va
conţine deoxiuridină în loc de o deoxitimidină, deosebindu-l de ADN nativ);
- amperaza: enzima care promovează amplificarea selectivă a ţintei şi distrugerea produşilor
de contaminare din cursul reacţiilor de amplificare anterioare; catalizează clivarea ADN-ului
care conţine deoxiuridina la începutul primului ciclu de amplificare şi nu degradează ADN-ul
sau ARN-ul ţintă .
4
Reacţia PCR se desfăşoară în 3 etape:

108