Page 109 - Ghidul Serviciilor Medicale Synevo, Ediția 2, Volum 1

GHIDUL SERVICIILOR MEDICALE 5
AL LABORATOARELOR SYNEVO METODE DE LUCRU

1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacţie la 94ºC, ADN-ul ţintă este separat
(denaturat) în 2 catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scăderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor ataşa
complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;
3. Elongaţia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabilă, în prezenţa Mn şi a
2+
excesului de deoxinucleotid-trifosfaţi (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si
deoxiuridina) va extinde primerii ataşaţi în lungul matriţei ţintei şi va produce un amplicon
ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de
obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de amplicon ADN (vezi fig.5.6.1) . 5

ADN tinta
P1 Taq P2

CICLUL I

CICLUL II

Fig.5.6.1.1

La rândul său, procesul global de amplificare desfăşurat de-a lungul unui număr definit de cicluri poate
fi divizat în 3 faze:
• Exponenţială: la fiecare ciclu se dublează cantitatea de amplicon ADN (se admite o
eficienţă de 100% a reacţiei).
• Lineară: pe măsură ce componentele reacţiei sunt consumate, se produce o încetinire a
reacţiei, iar produşii PCR încep să se degradeze.
• Platou (end-point): reacţia este stopată, nu se mai formează alţi produşi de amplificare, iar
dacă faza se prelungeşte mult produşii PCR vor suferi o degradare importantă.
Metodele PCR tradiţionale (convenţionale) au la bază o detecţie a produşilor PCR în faza de platou
a procesului (detecţie end-point). În ultimii ani, tehnologia PCR a fost revoluţionată prin dezvoltarea
metodelor de detecţie în faza exponenţială (detecţie în timp real: real-time PCR ).
Tehnologia real-time PCR prezintă numeroase avantaje faţă de cea convenţională:

109